[發明專利]具有改變的電子傳遞途徑的修飾珠蛋白

無效

• 申請號: 200880021531.1
• 申請日: 2008-06-26
• 公開（公告）號: CN101711255A
• 公開（公告）日: 2010-05-19
• 發明（設計）人: 克里斯托夫·埃里克·庫珀;米歇爾·托馬斯·威爾遜;布蘭東·喬恩·里德
• 申請（專利權）人: 威文和科技有限公司
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;A61K38/42;A61K9/00
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 吳貴明;張英

技術領域

本發明涉及修飾的載氧化合物(氧載化合物，oxygen-carryingcompound)例如血紅蛋白及它們的應用。

背景技術

用捐獻的血對患者輸血具有許多缺點。首先，可能缺少患者的血型。第二，存在捐獻的血可能被諸如肝炎病毒和HIV這樣的傳染原(病原體，infectious?agent)污染的危險。第三，捐獻的血保存期限有限。另外，存在一些其中血液可能不容易獲得的情形，例如戰場上或國內緊急事件的情形。

輸血的一種替代方案涉及使用血液代用品。血液代用品是一種也可提供對于保持血容量必要的滲透壓的載氧溶液。最近研究了兩種類型的代用品，即氟碳代血液(氟碳乳劑，fluorocarbon?emulsion)和血紅蛋白溶液。

存在于紅細胞中的血紅蛋白由兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈構成，它們各自載有一個血紅素分子。一條α樣珠蛋白鏈和一條β樣珠蛋白鏈結合而形成非常穩定的二聚體(dimer)。α樣和β樣珠蛋白基因屬于相關珠蛋白基因家族，其在不同發育階段被表達并受氧張力、pH和從胚胎到胎兒到新生兒的發育所調控。然后兩個二聚體以反平行方式排列而形成四聚體。二聚體結合而形成四聚體不如單體結合而締合成二聚體那么強。因此，四聚體具有分解而形成二聚體的趨勢且在四聚體、二聚體和單體之間總是存在一個平衡。在高濃度珠蛋白下，主要形式是四聚體；通過稀釋，二聚體變成主要形式。由于結合力部分是靜電的，所以這種平衡也受溶劑、鹽、pH和其它因素影響。

然而，使用天然的血紅蛋白作為血液代用品存在阻礙。首先，需要大劑量，需要大量生產蛋白，其通過重組方式或者來自捐獻的人血液或回收的非人血液。第二，獲得無傳染原和有毒物質的血紅蛋白很重要。第三，盡管血紅蛋白通常是68,000分子量的四聚體，但它可以分解而形成α-β二聚體。該二聚體被腎快速清除，并且對于無細胞血紅蛋白來說停留時間太短而不能用作血液代用品。

已經采取幾種方法以克服這些困難。這些方法包括通過重組DNA系統表達血紅蛋白、化學修飾血紅蛋白、以及生產血紅蛋白變體。血紅蛋白及其變體在包括大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞如CHO細胞的各種細胞體系中被表達。

已知血紅蛋白的許多天然變體。這些變體包括：自動聚合的變體、阻止四聚體分解的變體、以及在堿中穩定的變體。還有超過30種具有降低的氧親和性的天然血紅蛋白變體。這樣的變體的若干實例在WO88/091799中披露。

改善血紅蛋白使用的另一種方法是通過加入其他聚合物而修飾該蛋白，從而改善血液中該蛋白的穩定性。例如US?5,900,402描述了使用非抗原性聚合物，優選聚環氧烷(聚氧化烯烴或聚烷撐氧，polyalkylene?oxide)或聚乙二醇。

因為血紅蛋白(和實際上的肌紅蛋白或其它載氧蛋白)涉及氧的運輸和儲存，由于具有這種功能(因為蛋白的卟啉環中存在的鐵離子的氧化還原性質)，它們負責生成反應活性氧物種。含氧衍生物(Fe(II))的自動氧化導致生成非功能性的三價鐵血紅素(ferrichaem)(Fe(III))和超氧化物離子(O₂^-)，其隨后歧化而生成H₂O₂。這些物種最終能夠損害蛋白和/或血紅素基團。在導致這種破壞的途徑中的一個重要中間體是四價鐵血紅素(ferry?haem)(Fe(IV)＝O^2-)本身，其是通過血紅素與H₂O₂和脂過氧化物的反應形成的。蛋白/卟啉基自由基陽離子(P^+·)伴隨從三價鐵血紅素和過氧化氫生成四價鐵血紅素，如化學方程式(1)中列出的：

P-Fe(III)+H₂O₂→P^·+Fe(IV)＝O^2-+H₂O????(1)

盡管它們短暫存在，但是四價鐵血紅素和自由基也可能是有極大毒性的。這些氧化級聯可能是損害性的，因為：(i)過氧化氫是一種已知產生細胞損傷的強氧化劑，(ii)四價鐵血紅素和蛋白質基自由基都可以通過奪取氫原子而引發脂質、核酸和氨基酸的氧化，以及(iii)血紅素修飾可以導致產生對蛋白交聯物種的高毒性血紅素以及導致血紅素損失和“游離”鐵的釋放。