[發明專利]用于在原核生物中生產蛋白質的TAT信號肽

無效

• 申請號: 200880020335.2
• 申請日: 2008-06-02
• 公開（公告）號: CN101679958A
• 公開（公告）日: 2010-03-24
• 發明（設計）人: 鮑鍇;費爾南多·瓦耳
• 申請（專利權）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/62;C12N15/73;C12P21/02
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;林柏楠

本申請要求于2007年6月18日提交的美國臨時申請60/936,183，和 于2007年6月18日提交的美國臨時申請60/936,186的優先權。

政府支持

部分本工作得到了美國軍方Edgewood化學生物學中心(ECBC)合 同號BAA?ECBC-04的資助。因此，美國政府可以要求本發明的一定權利。

1.發明領域

本發明提供了編碼TAT融合蛋白的多核苷酸，以及用于在微生物中生 產目標蛋白質的方法。特別地，本發明涉及用于在宿主細胞，例如鏈霉菌 屬的宿主細胞中表達有機磷-降解酶，例如有機磷水解酶(OPH)的多核苷 酸、載體、多肽和方法。

2.發明背景

已經認識到在原核生物中存在兩種用于蛋白質跨細胞質膜轉運的途 徑。在多數細菌中，一般分泌(Sec)途徑是最詳細表征的蛋白質輸出途徑。 通過Sec途徑輸出的蛋白質以非折疊的狀態通過膜-嵌入的易位子 (translocon)跨膜，可切割的N-末端信號肽靶向所述易位子。

第二種一般的輸出途徑是雙-精氨酸轉運(Tat)途徑。不同于Sec系 統，Tat系統涉及預折疊蛋白質底物的轉運。靶向Tat途徑的蛋白質具有 N-末端信號肽，其包括在Tat信號肽的N-區域中保守的雙-精氨酸基序。

由于其分泌預折疊蛋白質底物的能力，Tat途徑代表了用于產生分泌 蛋白質的重要機制，可以利用所述途徑用于大規模生產蛋白質，所述蛋白 質用于對在多種農業殺蟲劑中和作為化學戰劑(例如，沙林、索曼和VX[O- 乙基-S-(2-二異丙基氨乙基)甲基硫代膦酸酯])使用的有機磷化合物解毒。

3.發明概述

本文教導的內容至少部分基于這樣的發現，即，可以利用細菌宿主細 胞中的Tat途徑生產一些蛋白質。因此，本發明提供編碼TAT融合蛋白的 多核苷酸，和用于在宿主細胞中生產目標蛋白質的方法。特別地，本發明 涉及用于在宿主細胞，例如鏈霉菌屬的宿主細胞中表達有機磷-降解酶，例 如有機磷水解酶(OPH)的多核苷酸、載體、多肽和方法。

在一個實施方案中，本發明提供了分離的多核苷酸，其包含可操作地 連接的第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列編碼TAT信號 肽，所述第二核酸序列編碼分類為EC?3.1.8蛋白質的磷酸三酯水解酶。在 另一個實施方案中，本發明的分離的多核苷酸包括可操作地連接的第一核 酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列編碼具有選自SEQ?ID?NO：1-5 的氨基酸序列的TAT信號肽，所述第二核酸序列編碼分類為EC?3.1.8蛋 白質的磷酸三酯水解酶。在另一個實施方案中，本發明的分離的多核苷酸 包括可操作地連接的第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列編 碼TAT信號肽，所述第二核酸序列編碼有機磷水解酶(OPH)。在另一 個實施方案中，有機磷水解酶是SEQ?ID?NO：18的OPH，或其變體。在另 一個實施方案中，本發明提供了分離的多核苷酸，包括可操作地連接的第 一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列編碼TAT信號肽，所述第 二核酸序列編碼分類為EC?3.1.8蛋白質的磷酸三酯水解酶，其中分離的多 核苷酸的第二核酸是密碼子優化的，用于在鏈霉菌屬宿主細胞中表達磷酸 三酯水解酶。在另一個實施方案中，本發明提供了分離的多核苷酸，包括 可操作地連接的第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列編碼 TAT信號肽，所述第二核酸序列編碼分類為EC?3.1.8蛋白質的磷酸三酯水 解酶，其中該分離的多核苷酸還可操作地連接SEQ?ID?NO：23的A4啟動 子。