[發(fā)明專利]作為細(xì)胞內(nèi)Icrac活性基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)的功能鑒定

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200880017095.0
• 申請(qǐng)日: 2008-03-21
• 公開（公告）號(hào): CN101730846A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萊因霍爾德·彭納;安德烈亞·弗萊格
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 皇后醫(yī)學(xué)中心
• 主分類號(hào): G01N33/50
• 分類號(hào): G01N33/50
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 羅天樂

相關(guān)申請(qǐng)的相互引用

本申請(qǐng)主張2007年3月23日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/896,572 的權(quán)益，并援引并入其全部?jī)?nèi)容用于所有目的。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及細(xì)胞內(nèi)的CRACM同源物(homolog)和Icrac活性。特 別地，本發(fā)明提供了用于確定細(xì)胞內(nèi)對(duì)Icrac活性有貢獻(xiàn)的CRACM同源物 的身份的方法和組合物。

發(fā)明背景

在許多細(xì)胞類型中，鈣池操縱的Ca²⁺內(nèi)流(store-operatedCa²⁺entry)是在 IP₃介導(dǎo)的Ca²⁺從細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放之后細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺持續(xù)升高現(xiàn)象的主要(即便 不是唯一的)機(jī)制。先前的研究已經(jīng)確定STIM1是ER腔內(nèi)Ca²⁺濃度的傳感 器，而CRACM1(或稱Orail)是質(zhì)膜內(nèi)的鈣釋放激活鈣(Calcium Release-ActivatedCalcium，CRAC)通道。鈣池的Ca²⁺一旦耗竭，STIM1便轉(zhuǎn) 移到質(zhì)膜下的小泡結(jié)構(gòu)(細(xì)孔(puncta))內(nèi)，在那里它可以結(jié)合并激活 CRACM1的多聚體組裝物。當(dāng)STIM1和CRACM1一起而非個(gè)別地過表達(dá) 時(shí)，可重建大CRAC電流。有三種哺乳動(dòng)物同源CRAC通道蛋白：CRACM1、 CRACM2和CRACM3。CRACM2已顯示在與STIM1共表達(dá)時(shí)可提高鈣池 操縱的Ca²⁺內(nèi)流并產(chǎn)生大的CRAC電流。盡管同一研究發(fā)現(xiàn)CRACM3不提 高鈣池操縱的Ca²⁺內(nèi)流，并且未觀察到電流，但是當(dāng)用siRNA敲低CRACM1 時(shí)CRACM3似乎使鈣池操縱的Ca²⁺內(nèi)流恢復(fù)到了正常水平。

鈣池操縱的鈣內(nèi)流是一種普遍存在的細(xì)胞功能元件，并且CRAC通道 對(duì)于多種細(xì)胞過程是必不可少的。CRAC通道同源物們顯示迥然不同的電 生理和藥理學(xué)性質(zhì)，因此需要提供一種方法和測(cè)定法來確定在不同細(xì)胞中 對(duì)Icrac活性有貢獻(xiàn)的CRAC通道的身份。

發(fā)明概要

因此，本發(fā)明提供用于確定不同的CRACM通道對(duì)細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的 貢獻(xiàn)的測(cè)定法、組合物和方法。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM1對(duì)細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢 獻(xiàn)的測(cè)定法。該測(cè)定法包括測(cè)量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動(dòng)力學(xué)、激活動(dòng) 力學(xué)和鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Icrac失活動(dòng)力學(xué)的慢速失活 相的鈣依賴性抑制表明CRACM1對(duì)所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM2對(duì)細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的 貢獻(xiàn)的測(cè)定法。該測(cè)定法包括測(cè)量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動(dòng)力學(xué)、激活 動(dòng)力學(xué)和鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Icrac失活動(dòng)力學(xué)的慢速失 活相的鈣依賴性抑制表明CRACM2對(duì)所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。

在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM3對(duì)細(xì)胞內(nèi)Icrac活性 的貢獻(xiàn)的測(cè)定法。該測(cè)定包括測(cè)量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動(dòng)力學(xué)、激活 動(dòng)力學(xué)和鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Icrac失活動(dòng)力學(xué)的慢速失 活相的鈣依賴性抑制表明CRACM3對(duì)所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3 對(duì)細(xì)胞Icrac活性的貢獻(xiàn)的測(cè)定法，包括測(cè)量所述Icrac活性的離子選擇性。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3 對(duì)細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測(cè)定法，包括測(cè)量2-APB存在下的Icrac活性。

在一個(gè)優(yōu)選的方面，通過測(cè)量如表1所述的Icrac活性的功能性質(zhì)的組 合來確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對(duì)細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)。

表I：CRACM同源物的功能性質(zhì)的區(qū)別性特征