[發明專利]抗體多肽在C-末端的偶聯

無效

• 申請號: 200880014111.0
• 申請日: 2008-02-08
• 公開（公告）號: CN101687917A
• 公開（公告）日: 2010-03-31
• 發明（設計）人: K·克加德;B·佩施克
• 申請（專利權）人: 諾沃-諾迪斯克有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;A61K47/48;C07K16/24
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 李 進;付 磊

發明領域

本發明涉及蛋白質化學領域，特別是涉及抗體片段的二聚化。

發明背景

對兩個獨立的抗原具有親合力的雙特異性抗體，先前已有描述(由 Holliger和Winter?1993Curr.Opin.Biotech.4，446-449綜述(也見Poljak， R.J.，等(1994)Structure?2：1121-1123；Cao等(1998)，Bioconjugate?Chem. 9，635-644)；Aramwit等，未來的藥物(Drugs?ofthe?Future)2005，30， 1013-1016；Moosmayer等Clin.Cancer?Res.2006，12，5587-5595)。這 樣的抗體可特別用于(除了別的以外)針對靶位，例如腫瘤的細胞毒性 劑或免疫效應器細胞的再定向(redirection)。迄今為止，已經通過采用 連接基連接兩個獨立抗體的VH和VL域建立了大多數雙特異性抗體， 所述連接基太短以至于不能使各域之間在同一鏈上配對，因而驅使互 補的域之間在不同的鏈上配對，以再建立兩個抗原-結合位點。這種類 型的抗體分子缺乏Fc域，并且因此缺乏抗體引發效應器功能的能力 (如補體激活，Fc-受體結合等)，并且由于其相對小的尺寸，半衰期通 常很短。雙特異性抗體應該含具有不同特異性的至少兩個抗體的抗原 -結合部分，并且兩個部分均可經重組表達。例如，Albrecht等 (Bioconjugate?Chem.2004，15，16-26.)描述了二聚化的ScFvs，其經二硫 代-連鍵而二聚化的。

已經用作兩個生物分子的共價軛合的間隔基的雙功能分子，已由 Li等描述(Bioorg.Med.Chem.Lett，2005，15，5558-5561)。然而，為了 雙特異性抗體構成物的制備，使用無論哪一種方法，兩個不同抗原- 結合部分的連接是制備中的關鍵問題。隨機二聚化將導致難以分離的 許多不同偶聯產物的混合物。用于控制相互反應的片段的連接的現有 的方法，為例如孔中的杵狀結構(knob-in-hole)突變(Carter，J.Immunol. Methods?2001，248，7-15.)、亮氨酸拉鏈(leucine-zippers)(Kostelny，等J. Immunol.1992，148，1547-1553.)或寡核苷酸配對(oligonucleotide pairing)(Chaudri等FEBS?Letters，1999，450，23-26.)。其中來自兩個具 不同特異性的抗體的重鏈和輕鏈抗體可變域稠合在一起，作為一條單 一多肽鏈的構成物也已被描述(Kipriyanov和Le?Gall，Current?Opinion in?Drug?Discovery&Development，2004，7，233-242.)。為制備雜-二聚構 成物，主要的問題是控制哪幾條單體將要形成二聚體。以作者的學識 認為，沒有現成的方法，其中的二聚化過程是僅靠化學反應控制的。

因而，對改良的和替代的用于生產二聚化抗體構成物，例如，雙 特異性抗體或其片段的方法存在需求，所述構成物是以商業上相應的 得率獲得的并且經歷純化。

發明簡述

為了克服以上提及的、用于使抗體片段二聚化的已知方法的局限 性，本發明現在提供用于使兩個抗體片段在各自重鏈(HC)C-末端二聚 化的方法，該方法包括修飾C-末端和使C-末端反應，以形成兩個抗 體片段間的共價鍵。本發明還提供含兩個抗體片段的二聚體的化合 物，其中所述抗體片段在它們的重鏈(HC)多肽的C-末端偶聯。本發明 還提供抗體片段，其中依據本發明對HC多肽的C-末端進行修飾。

依據由本發明提供的方法，一個抗體片段帶有一個化學官能團， 其不出現在第二個抗體片段中，而第二個抗體片段帶有另一個化學基 團，其不出現在第一個抗體片段中。當這兩種化學基團相互反應導致 化學鍵時，可獲得二聚化。

在具體的實施方案中，如在圖1中概述的，抗體二聚化的片段是 Fab-片段，各自包含至少與輕鏈(LC)相關聯的HC的可變域。然后， 連接HC多肽的C-末端以形成Fab2片段。

本發明的方法已經顯示對以高得率和純度產生二聚化的Fab-片段 是有用的，并且用于允許兩個組成的Fab-片段以保留完整的N-末端。 類似的原則可應用于其它抗體片段在HC多肽的C-末端的二聚化過 程。