[發(fā)明專利]用于制備甲基丙二酰輔酶A或乙基丙二酰輔酶A的酶及其用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200880010552.3
• 申請(qǐng)日: 2008-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN101720356A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M·波特;A·馬克斯;G·福克斯;B·艾爾伯;T·J·厄布
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司;阿爾貝特-路德維希斯弗賴堡大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12P7/42
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 羅菊華

本發(fā)明涉及分離的DNA，載體，所述載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的用途，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，多肽，相對(duì)于其野生型而言經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，用于制備經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的方法，通過所述方法獲得的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞的用途，以及用于制備有機(jī)C₃-和/或C₄-化合物的方法。

有機(jī)C₃-和C₄-化合物，例如3-羥基丙酸或3-羥基異丁酸(3-HIB)，是重要的化學(xué)前體，并且例如用于制備藥用活性物質(zhì)或在制備生物可降解的聚合物中用作組分。因此，3-羥基異丁酸例如適合于作為用于合成表卡托普利(Epicaptopril)(一種血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE)的抑制劑，其尤其用于治療高血壓)的前體。3-羥基異丁酸也可以通過脫水而轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酸。例如，使用3-羥基異丁酸通過脫水來制備丙烯酸，通過氧化來制備丙二酸，或者通過還原來制備1，3-丙二醇。

現(xiàn)有技術(shù)中已知用于制備3-羥基異丁酸或3-羥基丙酸的發(fā)酵方法。如此，US?4,618,583描述了一種用于制備3-羥基異丁酸的方法，其中用銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)或白黃精朊桿菌(Protaminobacter?alboflavus)這些種類的微生物將選自異丁酸、甲基丙烯酸、異丁酰氯、異丁酰氯的甲基酯、甲基丙烯酸的甲基酯、甲基丙烯酸的乙基酯、異丁醇、異丁醇的酯、異丁胺、異丁醛、異丁酰胺或其混合物的底物轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。WO-A-03/62173、WO-A-02/42418和WO-A-01/16346描述了借助于重組細(xì)胞從碳水化合物或甘油來制備3-羥基丙酸的方法，其中利用了不同的代謝途徑。

上面所描述的用于制備3-羥基異丁酸或3-羥基丙酸的發(fā)酵方法的缺點(diǎn)尤其在于，在發(fā)酵溶液中所形成的目標(biāo)產(chǎn)物的量太少了，以致不能將該發(fā)酵溶液用作用于大規(guī)模制備基于3-羥基異丁酸或3-羥基丙酸的第二產(chǎn)物(Folgeprodukt)的起始材料。

此外，在現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于制備3-羥基丙酸或3-羥基異丁酸的方法中，總是使用C₆-化合物例如葡萄糖或者C₃-化合物例如丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸或甘油，從而這些方法基本上限于使用碳水化合物或甘油作為碳源。然而，對(duì)于下列方面存在著日益增長的興趣：也從C₁-或C₂-碳源例如二氧化碳、甲烷、甲醇或乙醇來制備有機(jī)C₃-或C₄-化合物。然而，借助于現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，不可能以經(jīng)濟(jì)上合理的方式如此地從C₁-或C₂-碳源來合成C₃-或C₄-化合物。

本發(fā)明基于這樣的任務(wù)，即克服產(chǎn)生自現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。

特別地，本發(fā)明基于這樣的任務(wù)，即提供核酸序列，所述核酸序列編碼酶，所述酶當(dāng)在合適的細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，使得這些細(xì)胞能夠從合適的碳源，特別是從C₁-或C₂-碳源，以盡可能大的量產(chǎn)生有機(jī)C₃-和/或C₄-化合物，特別是3-羥基異丁酸或其衍生物。

本發(fā)明還基于這樣的任務(wù)，即提供酶，所述酶與現(xiàn)有技術(shù)中已知的酶相比較，在細(xì)胞中過表達(dá)該酶的情況下，決定性地改善細(xì)胞形成3-羥基異丁酸或其衍生物的能力。

此外，本發(fā)明還基于這樣的任務(wù)，即提供細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠比現(xiàn)有技術(shù)中所描述的細(xì)胞更好地，特別是更有效地從合適的碳源，特別是也從C₁-或C₂-碳源，制備在用于制備3-羥基異丁酸或其衍生物的方法中作為可能的中間產(chǎn)物的甲基丙二酰輔酶A或乙基丙二酰輔酶A，或者直接制備3-羥基異丁酸或其衍生物。

分離的DNA為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述分離的DNA選自下列序列：

a)根據(jù)SEQ?ID?NO：01的序列，

b)無內(nèi)含子的序列，其衍生自根據(jù)a)的序列并且與根據(jù)SEQ?IDNO：01的序列編碼相同的蛋白質(zhì)或肽，

c)編碼包含根據(jù)SEQ?ID?NO：02的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的序列，

d)與根據(jù)組a)至c)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的序列至少80％，特別優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％和最優(yōu)選地至少99％同一的序列，其中所述序列優(yōu)選地編碼能夠?qū)投辊］o酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A，和任選地也能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A的蛋白質(zhì)或肽，