[發明專利]包括用含3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培養基培養植物組織的共存步驟的提高植物轉化效率的方法

有效

• 申請號: 200880006564.9
• 申請日: 2008-02-28
• 公開（公告）號: CN101668418A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 石田佑二;樋江井佑弘
• 申請（專利權）人: 日本煙草產業株式會社
• 主分類號: A01H1/00
• 分類號: A01H1/00;C12N15/09
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 封新琴

技術領域

本申請要求2007年2月28日提交的日本國專利申請2007-49161的優 先權。

本發明涉及提高利用土壤桿菌的植物轉化的效率的方法。

背景技術

作為主要谷類即玉米、稻等單子葉植物的轉化方法，傳統上已知有電 穿孔法、粒子槍法等。但是，這些物理基因導入方法存在如下問題：導入 了多拷貝的基因，基因的插入不是完好形式，轉化植物多見畸形、不育， 等等。

利用土壤桿菌細菌的基因導入法作為雙子葉植物的轉化法有著普遍的 應用。土壤桿菌屬細菌的宿主僅限于雙子葉植物，認為其不能寄生在單子 葉植物中(非專利文獻1)，但正在嘗試用土壤桿菌轉化單子葉植物。

Grimsley等人報告稱：在土壤桿菌的T-DNA中插入玉米條紋病毒(Maize streak?virus)的DNA，再將其接種至玉米生長點，確認了玉米條紋病毒的感 染。而在僅接種玉米條紋病毒的DNA時，不能確認上述感染癥狀，可以解 釋成：以上現象表明土壤桿菌能夠向玉米中導入DNA(非專利文獻2)。但是， 病毒在未整合入核基因組的情況下仍具有增殖可能性，該結果并不能說明 T-DNA整合到核上。Grimsley等人進一步揭示：感染效率以接種至玉米的 莖頂部生長點時為最高(非專利文獻3)，其感染需要土壤桿菌的質粒的Vir?C 基因(非專利文獻4)。

Gould等人用針損傷玉米的生長點后，接種帶有卡那霉素抗性基因和 GUS基因的強病原性土壤桿菌EHA1，用卡那霉素選擇處理后的生長點， 結果得到了顯示抗性的植物。為了確認其子代的種子中具有導入的基因而 進行了Southren分析，結果對于一部分種子確認了導入基因(非專利文獻 5)。這提示：在用卡那霉素對經土壤桿菌處理的生長點進行選擇而得到的植 物體中，混合存在有轉化細胞和非轉化細胞(嵌合現象)。

Mooney等人嘗試了使用土壤桿菌對小麥的胚導入卡那霉素抗性基因。 首先，通過用酶處理胚使其細胞壁損傷，然后接種土壤桿菌。處理后的愈 傷組織中增殖出極少數的認為具有卡那霉素抗性的愈傷組織，但這些愈傷 組織不能再生成植物體。此外，在通過Southren分析來確認卡那霉素抗性 基因的存在時，在所有抗性愈傷組織中均觀察到導入基因的結構突變(非專 利文獻6)。

Raineri等人在損傷稻的胚盤后，用強病原性的土壤桿菌A281(pTiBo542) 處理了稻的8個品種，在日本晴、藤坂5號這2個品種中觀察到腫瘤狀組 織的增殖。而且，將帶有下述質粒的土壤桿菌接種于稻胚，觀察到卡那霉 素抗性愈傷組織的增殖，所述質粒是在從T-DNA中除去激素合成基因而得 的Ti質粒中插入卡那霉素抗性基因和GUS基因而得到的。在該抗性愈傷組 織中，確認到了GUS基因的表達，但不能獲得轉化植物。這些可以解釋為： 土壤桿菌的T-DNA被導入到稻的細胞中(非專利文獻7)。

如上述，有研究報告揭示：在稻、玉米、小麥等稻科作物中也能夠利 用土壤桿菌進行基因導入。然而，其都存在再現性的問題，此外，關于導 入基因的確認是不完全的、沒有給出有說服力的結果(非專利文獻8)。

Chan等人報告：將在2，4-D共存下培養了2天的稻未成熟胚損傷后， 在含馬鈴薯懸浮培養細胞的培養基中對其接種了帶有npt?II基因和GUS基 因的土壤桿菌。在含G418培養基上培養經過處理的未成熟胚，結果由誘導 產生的愈傷組織得到了再分化植物體。在通過Southren分析確認再分化植 物體及其子代植物體中的GUS基因的存在時，確認了無論是再分化本代還 是子代植物體中均存在導入基因(非專利文獻9)。該結果支持用土壤桿菌轉 化稻，但轉化效率非常低，僅為1.6％，相對于供試的250個未成熟胚，顯 示正常生長的再生植物體只有1個個體。為了摘出稻的未成熟胚，需要大 量勞力，因此很難說這樣的低轉化效率到達了實用水平。

近年來，有報告稱：通過利用具有強病原性土壤桿菌的一部分病原性 基因的超級二元載體，即使在稻、玉米等單子葉植物中，也能夠進行穩定、 高效率的轉化(非專利文獻10和11)。這些報告認為，利用土壤桿菌進行的 轉化除了能夠實現穩定、高效率的轉化之外，還具有下述優點：所得轉化 植物的突變少，導入基因的拷貝數少、且多為完好形式。繼在稻、玉米中 取得成功之后，還有報告稱在主要谷類即小麥(非專利文獻12)、大麥(非專 利文獻13)和蜀黍(非專利文獻14)中利用土壤桿菌進行了轉化。