[發明專利]組織工程皮膚培養及增殖活力的檢測方法

無效

• 申請號: 200810305499.1
• 申請日: 2008-11-12
• 公開（公告）號: CN101392237A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 陸洪光
• 申請（專利權）人: 陸洪光
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61L27/60;G01N33/53;G01N15/10
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及一種組織工程皮膚培養及增殖活力的檢測方法。

背景技術

組織工程皮膚可用于皮膚創傷如損傷、燒傷等后皮膚的移植、美容換膚及一些嚴重的皮膚病的治療，有著廣泛的應用前景和潛在的發展空間(Ehrenreich?M，Ruszczak?Z.Update?on?tissue-engineered?biological?dressings.Tissue?Eng，2006，12：2407-2424.)。在組織工程皮膚培養過程中，保持種子細胞的增殖活力是皮膚發育的關鍵，也是判定移植后皮膚能否存活的重要參考依據。因此，為了促進組織工程皮膚細胞的增殖活力，人們不斷探索適當的培養條件并在培養基中添加各種生物成分，如牛垂體提取物、重組人表皮生長因子(hEGF)等，以便預期得到足夠量的皮膚用于臨床實際應用(Poumay?Y，Dupont?F，Marcoux?S，et?al.A?simple?reconstructed?humanepidermis：preparation?of?the?culture?model?and?utilization?in?in?vitro?studies.Arch?Dermatol?Res，2004，296(5)：203-211.)。為此，在組織工程皮膚培育過程中掌握和了解組織工程皮膚的增殖能力和活力，對于判斷和憑估組織工程皮膚培養條件及培養基營養成分，以便及時進行適當干預和調整有重要的實際應用價值和意義。

目前在生物醫學領域用于細胞增殖的標記物主要有Ki67，PCNA(Proliferating?cellnuclearantigen)及Brdu(5-bromo-2--deoxyuridine)等。以往在細胞生物學研究中人們常采用同位素標記，但同位素存在放射污染，技術難度大，實驗周期長等缺點，使實驗應用受到限制。國外Gibbs?S等用Ki67對體外培養的皮膚組織進行增殖活力的觀察(Gibbs?S，SilvaPinto?AN，Murli?S，et?al.Epidermal?growth?factor?and?keratinocyte?growth?factordifferentially?regulate?epidermal?migration，growth，and?differentiation.WoundRepReg2000；8：192-203)。我們也曾用同樣方法對體外培養的皮膚組織進行增殖活力的研究(陸洪光等，中華皮膚科雜志2005；38(12)：738—741.)。Ki67不失為一種清晰標記的核抗原，但是在實際應用中，需要終止皮膚組織培養，然后再進行Ki67的檢測。Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，能被S期細胞攝入，代替胸腺嘧啶在DNA合成期摻入DNA中，因活體組織細胞內無內源性Brdu存在，所以人們常用Brdu結合抗Brdu單抗標記檢測活體組織細胞，以判斷其增殖活力。自1982年Gratzer制備出抗Brdu單抗及標記檢測技術不斷改良提高，應用Brdu標記的敏感性已與氘胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)相似。目前Brdu作為增殖細胞標記物得到廣泛應用(Kormack?DR，Pakic?P.Cell?proliferation?without?neurogenesis?in?adult?primateneocortexScience.2001；294：2127--30.)。然而，由于Brdu是外源性細胞標記物，若對整個培養的組織工程皮膚加入Brdu后檢測其增殖性，會干擾和影響皮膚組織的生長發育，并且由于活組織的BrdU標記可能會帶來組織工程皮膚質量、及后來用于人體皮膚移植的安全性會有影響，因此找出一種理想的、既能客觀檢測組織工程皮膚增殖活力又不影響皮膚生長的方法十分必要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種組織工程皮膚培養及增殖活力的檢測方法，以克服現有技術存在的干擾和影響皮膚組織的生長發育的不足。