[發(fā)明專利]靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810302536.3
• 申請日: 2008-07-04
• 公開（公告）號: CN101306200A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣德席;沈中陽;魏憲義;蹇遠(yuǎn)勇;肖黃根;劉文芳
• 申請（專利權(quán)）人: 四川遠(yuǎn)大蜀陽藥業(yè)股份有限公司;蔣德席;沈中陽
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;C07K16/06;C07K1/14;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所
• 代理人: 武森濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，屬于血液制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)

我國是乙型肝炎(HBV)感染的高發(fā)地區(qū)，1992年全國病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查證實：人群中乙肝表面抗原(HBsAg)陽性率為9.75％，由此推算HBsAg攜帶者達1億2千萬人；在HBV攜帶者中，約四分之一會發(fā)展為慢性肝病，因此全國慢性乙肝肝病可能不小于3千萬。目前，國內(nèi)外對乙型肝炎的治療，尚無十分有效的方法，從而使許多病人最終發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。

肝移植(LT)是目前能夠延長終末期肝病患者生命的唯一方法。在我國，與肝炎病毒感染有關(guān)的急慢性肝病是LT的主要適應(yīng)癥。患者肝移植后的存活率受多種因素影響，乙肝的復(fù)發(fā)為主要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化的病人，如果術(shù)前HBsAg陽性伴有HBV復(fù)制(HBeAg或HBV?DNA陽性)，術(shù)后一年乙型肝炎復(fù)發(fā)率為80-90％，如果術(shù)前HBsAg陽性而病毒沒有復(fù)制，其術(shù)后一年內(nèi)的復(fù)發(fā)率也高達為40-50％。由于使用免疫抑制劑，肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)的病人預(yù)后很差，可在短期(一般2～3年)內(nèi)再次肝硬化，且急性重癥肝炎的發(fā)生率也很高。因此有效預(yù)防乙型肝炎的復(fù)發(fā)是此類病人術(shù)后存活的關(guān)鍵。

國外文獻報道，使用高效價乙肝免疫球蛋白可使LT后HBsAg陽性率降至17％～29％。歐洲多中心臨床研究證實長期應(yīng)用人乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)可減少乙肝肝硬化LT后的HBV復(fù)發(fā)率，可延長生存期。因此在發(fā)達國家IV-HBIG已成為預(yù)防肝移植后HBV再感染的常規(guī)治療方法。有研究表明，乙型肝炎表面抗體(Hepatitis?B?surface?Antibody，HBsAb)必須保持在100～500IU/ml才能有效預(yù)防肝移植后HBV的再感染。乙肝相關(guān)肝移植病人HBIG使用劑量為術(shù)中、術(shù)后連續(xù)7天每天2000IU-10000IU，以后HBIG保持在500IU/L以上，即使在與拉米夫定聯(lián)合應(yīng)用的情況下，要達到有效保護水平的血濃度所需注射的劑量也較大。目前，已有HBIG肌肉注射產(chǎn)品上市，但肌肉注射在使用上很不方便，移植時4000、移植后每天2000IU連續(xù)使用7天，每天40或20ml的注射體積需要不斷變換部位多點注射病人十分痛苦。申請?zhí)枮?00710144634.4的發(fā)明專利申請，公開了一種靜脈注射乙型肝炎免疫球蛋白制備方法，但該方法IgG的收率偏低，且純度不夠高(為98％)，該方法采用納米膜過濾病毒，但濾膜孔徑≤20納米時，膠狀液體(蛋白溶液)難以過濾，濾膜孔徑為50納米時人細(xì)小病毒B19又無法去除，使制備的產(chǎn)品存在安全隱患。因此，本領(lǐng)域目前迫切需求一種純度高、安全性好的制備靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述不足提供一種制備靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的方法。

本發(fā)明靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟：

a、融化血漿：將乙型肝炎表面抗體效價≥8IU/ml的原料血漿于0～4℃融化；

b、組分分離：用質(zhì)量百分含量為0.9％的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質(zhì)含量為45～55g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.4，加入95％乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8％，反應(yīng)過程溫度控制在2.5±0.5℃，離心分離上清液，即得FI反應(yīng)液；

c、過濾：將FI反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH值至6.80±0.10，加入95％乙醇至乙醇終濃度為20％，將反應(yīng)液溫度控制在5.0±0.5℃，加入硅藻土吸附雜質(zhì)，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；

d、沉淀溶解：將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.10±0.05，調(diào)節(jié)溶液離子強度為0.01，加入95％乙醇至溶液中乙醇濃度為17％，控制溶液溫度為-4.5±0.5℃，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；

e、濾液沉淀：FII濾液中加入氯化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液離子強度為0.05，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.90±0.05，加入95％乙醇至溶液中乙醇濃度為25％，每升乙醇補加1mol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應(yīng)液溫度為-7.5±0.5℃，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；

f、層析：FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；

g、超濾：將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調(diào)節(jié)超濾液中蛋白濃度為15±5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)超濾液pH值至4.8±0.1、電導(dǎo)率不超過350uS/cm；