[發明專利]一種重組豬α-干擾素及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 200810249818.1
• 申請日: 2008-12-29
• 公開（公告）號: CN101475635A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 姜正軍;陳溥言;劉剛;蘇曉明;孫麗紅;劉璐璐;崔麗萍;王茂超;柳少杰
• 申請（專利權）人: 山東華辰生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C12N15/21;C12N15/81;C12N1/19;A61K38/21;A61K9/08;A61K47/42;A61K47/36;A61K47/12;A61P31/12;A61P37/02
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 程凌軍

技術領域

本發明涉及一種重組豬α干擾素及其制備方法與應用，屬于禽畜藥物生產技術領域。

背景技術

豬干擾素(PoIFN-α)是一類具有抗病毒和免疫調節活性的細胞因子，是豬體抵御病原入侵的重要早期防御系統之一。應用基因工程的方法表達的重組豬干擾素具有與天然干擾素高度相似的抗病毒等生物學活性，因此，重組豬干擾素可以作為一類高效的抗病毒和免疫調節生物制劑。

公開號為CN1611604的中國專利申請，公開了一種利用大腸桿菌進行豬α-干擾素的基因合成、表達載體構建及產物的制法，屬于用分子生物學方法獲得的基因工程生物制品。它設計合成了大腸桿菌偏嗜密碼子組成的豬α-干擾素基因，并構建了帶有該基因的高效表達載體，實現了豬α-干擾素在大腸桿菌中的高效表達。表達量占菌體總蛋白的26％，雖然該專利文件提供了一整套工程菌誘導表達、包涵體分離和裂解、蛋白復性及純化工藝，但是大腸桿菌表達的PoIFN-α是以包涵體的形式存在，需經過提取、變性、復興和純化后才具有活性，工藝復雜，過程繁雜，并且大腸桿菌等原核表達系統，與真核生物的表達系統有較大差異，導致制得的產品活性不高。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種重組豬α-干擾素及其制備方法與應用。

本發明的重組豬α-干擾素是將豬α-干擾素基因通過表達載體導入畢赤酵母菌，再通過重組畢赤酵母菌的誘導表達、發酵和后提取制得。

一種重組豬α干擾素的制備方法，包括豬α-干擾素表達載體的構建、重組畢赤酵母菌的誘導表達、發酵工藝和后提取工藝，其特征在于，所述的發酵工藝步驟如下：

(1)種子液的制備

將通過表達載體導入豬α-干擾素基因(PoIFN-α)的重組畢赤酵母菌劃線接種到YPDS+zeocin平板上，28～30℃培養90～100小時后，挑單菌落接種到YPD液體培養基中，28～30℃搖床培養16～18小時，得種子液；所述種子液在無菌條件下取樣測OD₆₃₀值在0.6～0.8，pH值在5.5～6.0，鏡檢無雜菌存在；

YPDS+zeocin平板可參考本領域常用成分配制，也可按如下成分配制：

酵母提取物1wt％，蛋白胨2％，葡萄糖2wt％，瓊脂2wt％，Zeocin抗生素100μg/ml，山梨醇1mol/L。

YPD液體培養基可參考本領域常用成分配制，也可按如下成分配制：2wt％蛋白胨、1wt％的酵母提取物、2wt％的葡萄糖，余量為水。

(2)發酵

將占總體積10～20％的種子液接種至BMGY/BMMY液體培養基，溫度28～30℃，pH5.5～6.5，攪拌轉速為350～400rpm/h，誘導發酵48小時，取發酵液；誘導培養18小時后，開始每小時流加甲醇，甲醇體積占發酵液體積的0.5～1.8％。

BMGY液體培養基可參考本領域常用成分配制，也可按如下成分配制：

10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，13.4g/L?YNB，0.4mg/L生物素，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液。

BMMY液體培養基可參考木領域常用成分配制，也可按如下成分配制：

10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液，13.4g/L?YNB，0.4mg/L生物素，5mL/L甲醇。

所述的豬α-干擾素表達載體的構建可參考專利200310109820.6中描述的合成豬α-干擾素的相關步驟及參考Invitrogen公司出售的表達載體pPICZα-A的產品使用說明書，先構建pPICZαA-PoIFN-α后，以pPICZαA-PoIFN-α為模板，利用設計好的引物PCR擴增；再用XbaI和XhoI內切酶雙酶切插入定向位點獲得pPICZαA-PoIFN-α重組載體。對重組體進行線性化后電擊轉化于畢赤氏巴斯德酵母(簡稱：畢氏酵母)Pichia?pastoris受體菌X-33感受態細胞中獲得Zeozin^TM抗性克隆，從中篩選Mut⁺菌落，即為重組畢赤酵母菌。

所述的重組畢赤酵母菌的誘導表達采用如下步驟實現：