[發(fā)明專利]一種重組豬α-干擾素及其制備方法與應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810249818.1
• 申請(qǐng)日: 2008-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN101475635A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜正軍;陳溥言;劉剛;蘇曉明;孫麗紅;劉璐璐;崔麗萍;王茂超;柳少杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東華辰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/56
• 分類號(hào): C07K14/56;C12N15/21;C12N15/81;C12N1/19;A61K38/21;A61K9/08;A61K47/42;A61K47/36;A61K47/12;A61P31/12;A61P37/02
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 程凌軍

1、重組豬α-干擾素，其特征是將豬α-干擾素基因通過表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母菌，再通過重組畢赤酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)、發(fā)酵和后提取制得。

2、一種重組豬α-干擾素的制備方法，包括豬α-干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建、重組畢赤酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)、發(fā)酵和后提取，其特征在于，所述的發(fā)酵步驟如下：

(1)種子液的制備

將含有豬α-干擾素基因的重組畢赤酵母菌劃線接種到Y(jié)PDS+zeocin平板上，28～30℃培養(yǎng)90～100小時(shí)后，挑單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28～30℃搖床培養(yǎng)16～18小時(shí)，得種子液；所得種子液在無菌條件下取樣測(cè)OD₆₃₀值在0.6～0.8，pH值在5.5～6.0，鏡檢無雜菌存在；

(2)發(fā)酵

將占總體積10～20％的種子液接種至BMGY/BMMY液體培養(yǎng)基，溫度28～30℃，pH5.5～6.5，攪拌轉(zhuǎn)速為350～400rpm/h，誘導(dǎo)發(fā)酵48小時(shí)，取發(fā)酵液。

3、如權(quán)利要求2所述的重組豬α-干擾素的制備方法，其特征在于，步驟(2)中誘導(dǎo)發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)發(fā)酵18小時(shí)后，開始每小時(shí)流加甲醇，甲醇體積占發(fā)酵液體積的0.5～1.8％。

4、如權(quán)利要求2所述的重組豬α-干擾素的制備方法，其特征在于，所述的后提取步驟為：

將經(jīng)重組畢赤酵母菌發(fā)酵后的發(fā)酵液離心處理，離心溫度4～10℃，轉(zhuǎn)速為10000～12000rpm；經(jīng)0.22um的板框過濾后，用10萬分子量的膜包超濾，取清液，再經(jīng)過6千分子量的膜包超濾收集濃縮液，最后采用0.22um孔徑的微濾，在無菌條件下收集得到豬α-干擾素原液。

5、如權(quán)利要求2所述的重組豬α-干擾素的制備方法，其特征在于，所述的重組畢赤酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)采用如下步驟：

將篩選的重組畢赤酵母菌接種于BMGY培養(yǎng)液，28～30℃震蕩培養(yǎng)16～20h，OD₆₀₀為4.0-6.0，2800～3500rpm離心5min收集重組畢赤酵母菌，用BMMY培養(yǎng)液重懸重組畢赤酵母菌并調(diào)節(jié)濃度至OD₆₀₀值為0.8～1.2，28～30℃震蕩培養(yǎng)24h，補(bǔ)加甲醇至BMMY培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液的甲醇體積濃度為0.5～1.8％，連續(xù)培養(yǎng)3天，保留的酵母菌即為通過表達(dá)載體導(dǎo)入豬α-干擾素基因的重組畢赤酵母菌，取培養(yǎng)液檢測(cè)PoIFN-α的表達(dá)。

6、如權(quán)利要求5所述的重組豬α-干擾素的制備方法，其特征在于，采用如下方法檢測(cè)PoIFN-α的表達(dá)：將培養(yǎng)液10000rpm離心8min，取上清，用0.45um的濾膜過濾后，用PBS透析24～72h時(shí)間，再以PEG20000反透析濃縮24～48時(shí)間，用0.22μm的濾膜過濾除菌后，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

7、一種權(quán)利要求1所述的重組豬α-干擾素的應(yīng)用，用于制備重組豬α-干擾素注射劑，重量百分比組分如下：

重組豬α-干擾素原液8％～10％，藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑1％～5％，藥學(xué)上可接受的蛋白保護(hù)劑0.1％～0.5％，藥學(xué)上可接受的防腐劑0.1‰～0.5‰，余量注射用水，pH5.0～6.0。

8、如權(quán)利要求7所述的重組豬α-干擾素的應(yīng)用，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑為黃芪多糖。

9、如權(quán)利要求7所述的重組豬α-干擾素的應(yīng)用，其特征在于，藥學(xué)上可接受的蛋白保護(hù)劑為白蛋白。

10、如權(quán)利要求7所述的重組豬α-干擾素的應(yīng)用，其特征在于，藥學(xué)上可接受的防腐劑為苯甲酸，藥學(xué)上可接受的緩沖液為磷酸緩沖液。