[發(fā)明專利]褐點石斑魚心臟細胞系的構建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810249565.8
• 申請日: 2008-12-26
• 公開（公告）號: CN101451121A
• 公開（公告）日: 2009-06-10
• 發(fā)明（設計）人: 樊廷俊;魏云波;姜國建
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 張中南

技術領域

本發(fā)明涉及一種利用褐點石斑魚心臟組織細胞建立心臟細胞系的方法——褐點石 斑魚心臟細胞系的構建方法。

背景技術

石斑魚是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶海域，我 國南海及東海南部均有分布。褐點石斑魚(Epinephelus?fuscoguttatus)俗稱“老虎斑”， 是一種具有較高的經濟價值名貴石斑魚。近年來，各種魚類病毒性疾病大規(guī)模爆發(fā)， 造成石斑魚養(yǎng)殖業(yè)巨大的經濟損失，已經成為制約魚類養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素 之一。魚類細胞系正是研究病毒感染途徑、感染機理以及研制病毒疫苗的重要研究體 系，另外，隨著海洋環(huán)境污染的日益加劇，海洋中各種環(huán)境污染物，包括基因毒物、 誘變劑、致癌物、環(huán)境激素和內分泌干擾物等對水產養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來了極大的 威脅，利用魚類細胞系作為環(huán)境毒理學研究環(huán)境污染物的模型，進行環(huán)境污染監(jiān)測和 安全性評價，也成為魚類細胞培養(yǎng)的重要用途之一。目前，由于海洋魚類細胞系特別 是褐點石斑魚各種組織細胞系的缺乏，褐點石斑魚病毒學和環(huán)境毒理學等方面的研究 受到阻礙，其它海洋魚類細胞系不能有效的對褐點石斑魚病毒進行分離、鑒定、繁殖， 研制病毒疫苗以及研究病毒與宿主細胞相互作用，也無法針對性的檢測海洋中存在的 各種環(huán)境污染物對褐點石斑魚的影響，并研究污染物對褐點石斑魚細胞的作用機理。

顯然，建立褐點石斑魚各種組織細胞系是非常必要的，可為魚類病毒學和環(huán)境毒 理學等相關研究奠定堅實的基礎，為石斑魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟效益，褐點石斑魚 各種組織細胞系還可作為海洋污染早期預警的主要手段之一，對海洋中存在的各種環(huán) 境污染物進行監(jiān)測和安全性評價，促進水產養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的就是利用褐點石斑魚心臟組織，提供一種褐點石斑魚心臟細胞系的 構建技術，以彌補現有技術的不足。

本發(fā)明的構建方法：首先對鮮活褐點石斑魚用濃度均為1000單位/毫升的青霉素 和鏈霉素的高雙抗海水消毒處理24小時，以75％酒精再次消毒，置于超凈工作臺中解 剖取下心臟組織，磷酸鹽緩沖液漂洗后剪成大致1立方毫米的組織塊；選擇濃度為 0.0625％～0.125％的胰蛋白酶對心臟組織塊消化5-10分鐘，并離心收集心臟組織塊； 將該心臟組織塊用含有5％胎牛血清和0.25‰～1‰比例的硫酸軟骨素的pH值為7.0～7.4 的DMEM/F12培養(yǎng)液充分懸浮，均勻接種于多個25毫升培養(yǎng)瓶中，22～24℃下正置干 貼16～20小時后，每瓶加入5毫升褐點石斑魚心臟細胞專用增殖培養(yǎng)液，置22～24℃ 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，再添加 2.5毫升上述褐點石斑魚心臟細胞專用增殖培養(yǎng)液；待褐點石斑魚心臟細胞長成單層 后，再使用濃度為0.125％～0.25％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培 養(yǎng)；所述的褐點石斑魚心臟細胞專用增殖培養(yǎng)液配方為含有20％胎牛血清和0.25‰～1 ‰比例的硫酸軟骨素、pH值為7.0～7.4的DMEM/F12培養(yǎng)液。為了促進褐點石斑魚心 臟細胞的分裂和快速增殖，本發(fā)明又添加了0.01‰～0.02‰的人堿性成纖維細胞生長因 子、0.04‰～0.06‰的I型人胰島素樣生長因子和20％-40％的已抽濾的對數期褐點石斑 魚鰭細胞培養(yǎng)上清液。

本發(fā)明構建的主要特點是：褐點石斑魚心臟細胞系可以連續(xù)傳代，既可為魚類病 毒學等多種相關研究提供理想的體外研究，又可作為環(huán)境毒理學研究環(huán)境污染物的模 型，進行環(huán)境監(jiān)測和安全性評價。經這種方法所構建的心臟細胞系現已傳至第70代。

具體實施方式

將上述本發(fā)明的方法按照細致步驟進行詳述如下：