[發明專利]O139群霍亂弧菌檢測用組合物、試劑盒和檢測方法

無效

• 申請號: 200810247464.7
• 申請日: 2008-12-31
• 公開（公告）號: CN101768633A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 蔡劍平;龔成;吳麗娟;楊輝;胡繼紅
• 申請（專利權）人: 蔡劍平
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 北京德琦知識產權代理有限公司 11018
• 代理人: 徐江華;王珍仙

技術領域

本發明涉及霍亂弧菌的特異性檢測用組合物、試劑盒和檢測方法，特別涉及O139群霍亂弧菌的特異性檢測用組合物、試劑盒和檢測方法。?

背景技術

霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio?chlorae)引起的烈性腸道傳染疾病，患者的臨床癥狀常表現為大量米湯狀排泄，造成迅速脫水。如不及時治療，可導致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡。霍亂弧菌按照血清型可分為多個群，但是并不是所有的群都能引起疾病的流行。其中，能夠引起霍亂流行的主要有兩種血清型：O1群和O139群(Kaper?JB，Morris?JG，Levine?MM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev，1995，8：48-86)。因此在霍亂弧菌的檢測中，其血清型分型是有效檢測的重要組成部分。?

就其致病性檢測指標來說，早期研究發現，霍亂的強致病作用主要是因為霍亂弧菌分泌的霍亂毒素導致的腹瀉所致。因此在O139群霍亂弧菌引發的霍亂出現之前，一直使用霍亂毒素(cholera?toxin，CT)作為檢測其病原性的標準。歷史上的前7次霍亂流行都由O1群霍亂弧菌引發。在1992年末，在印度出現了由O139群引發的霍亂，并迅速傳至周圍國家。自從O139群霍亂弧菌引發霍亂爆發以后，并且隨著對O139群和O1群霍亂弧菌研究的深入，發現有一些非O139群也非O1群的霍亂弧菌也表達霍亂毒素CT，但是并不會引發霍亂的爆發。同時，在偶然情況下O1和O139群霍亂弧菌由于缺失ctx基因而不表達霍亂毒素，同時也不會引發霍亂的爆發。所以，要準確檢測致病性霍亂弧菌的存在需要同時檢測兩個指標：霍亂毒素CT和血清型指標(Chakraborty?S，Mukhopadhyay?AK，Bhadra?RK，et?al.Virulencegenes?in?environmental?strains?of?Vibrio?cholerae.Appl.Environ.Microbiol，2000，66：4022-4028)。?

鑒于霍亂流行的危害性較大，使霍亂弧菌的檢測尤為重要。但是傳統的弧菌檢測法需要先用堿性蛋白胨培養液培養增菌，培養分離出菌株之后才能檢測，由于其對菌株培養的需要，使這種傳統檢測方法并不總是適用。因為霍亂弧菌在嚴苛的生存條件下，例如抗生素、營養素缺乏、氣候寒冷等，就會進入一種可存活但不可培養的狀態，不適于基于菌株培養的傳統檢測方法(Lyon?WJ.TaqMan?PCR?for?detection?of?Vibrio?cholerae?O1，O139，non-O1，and?non-O139?in?pure?cultures，raw?oysters，and?synthetic?seawater.Appl.Environ.Microbiol，2001，67：4685-4693)。并且，傳統弧菌檢測方法耗時較長，不利于對樣品的迅速檢測處理。由于傳統的霍亂弧菌檢測方法費時費力，不利于快速檢測，并且涉及菌的培養，對于操作人員來說具備一定的危險性，近年來針對霍亂及霍亂毒素的PCR反應快速檢測技術開始出現。對于PCR檢測來說，引物的選擇至關重要，直接影響檢測的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導致檢測的假陽性結果或者假陰性結果的出現。另外，對于產毒型霍亂弧菌的檢測，單獨檢測一個基因，往往不足以判斷其致病性。2003年Fukushima等利用SYBR熒光染料建立了多重熒光實時PCR檢測體系(Hiroshi?F，Yoshie?T，Ryotaro?S.Duplex?real-time?SYBR?Green?PCR?assaysfor?detection?of?17?species?of?food?or?waterborne?pathogens?in?stools.J.Clin.Microbiol，2003，41：5134-5146)，雖然縮短了檢測時間和工作量，但是由于采用非毒素基因的單一靶位點檢測，用于檢測致病菌時，其檢測結果存在一定的假陽性率。?

對于食品等樣品中霍亂弧菌的檢測是預防與監測霍亂的重要步驟。并且霍亂弧菌的檢測對于患者疾病的確診與菌株的分型也有重要意義。?

發明內容

為了更加準確地特異性檢測樣品O139群霍亂弧菌的存在，本發明提供?一種特異性檢測樣品中O139群霍亂弧菌的組合物。該組合物包括下列引物：?

上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′(序列號：1)；?