[發明專利]環介導等溫擴增檢測人前列腺癌特異基因DD3PCA3試劑盒

無效

• 申請號: 200810244722.6
• 申請日: 2008-11-26
• 公開（公告）號: CN101423873A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發明（設計）人: 朱斌;賈瑞鵬;葛海燕
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司
• 代理人: 陶海鋒

技術領域

本發明涉及一種定性檢測基因的試劑盒及檢測方法，具體涉及一種定性檢測人前列腺癌特異基因DD3^PCA3的試劑盒及檢測方法。

背景技術

前列腺癌位(Pca)居西方國家男性癌癥發病率的第二位，在我國及亞洲國家，前列腺癌的發病率近年也在明顯增高，有統計說明，我國前列腺癌已居泌尿男生殖系統腫瘤的前三位，而且發病年齡也日趨年輕化，前列腺癌的早期治療可能使患者獲得治愈，所以早期診斷和治療對愈后至關重要。

目前臨床通過檢測前列腺特異性抗原(PSA)，達到診斷前列腺癌的目的。但PSA為前列腺特異性抗原，而非前列腺癌特異性抗原，在前列腺增生癥和前列腺炎等良性前列腺病變中亦可升高，且近來有研究發現PSA在前列腺以外的器官亦可能高表達，暴露出PSA在Pca診斷中的局限性。

因此，尋找更為敏感、特異的腫瘤標記物用于Pca的早期診斷和預后檢測具十分重要的意義。

DD3^PCA3是前列腺癌的特異性基因，在前列腺癌組織中高度表達，正常前列腺組織或者前列腺增生中無表達或低表達，其他腫瘤組織及器官中均無表達。核酸擴增(PCR)為基礎的分子生物學技術的迅速發展，為DD3^PCA3的檢測提供了一種快速、靈敏的方法，但普通PCR假陽性太高，不適合臨床使用。熒光定量PCR具有靈敏、準確的優點，但采用TaqMan探針法操作煩瑣、費用較高。

環介導等溫擴增(Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)不需PCR經過的變性、復性、延伸三個階段，可在等溫條件下1小時內將目的序列擴增10⁹倍以上，因此不需特殊設備，檢測時間更短、敏感性更高；同時4條的特異性引物識別靶基因的6個特定區域，特異性更高，因此在基因檢測上明顯優于PCR。

但在實際應用中，引物設計及實驗條件優化比較煩瑣，所以至今國內外尚未見有關LAMP檢測前列腺癌特異基因DD3^PCA3的文獻和專利報道。

發明內容

本發明目的是解決環介導等溫擴增檢測前列腺癌特異基因DD3^PCA3技術領域的難點，設計合適的引物和優化的測試條件，提供一種定性檢測人前列腺癌特異基因DD3^PCA3的試劑盒及檢測方法，解決了普通PCR假陽性太高和熒光定量PCR存在的費用高的問題。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：一種環介導等溫擴增檢測人前列腺癌特異基因DD3^PCA3的引物，其特征在于：由一對外引物和一對內引物組成，其序列分別如下所示：

外引物1具有序列表中SEQ?ID?NO.2所述的堿基序列，具體序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；

外引物2具有序列表中SEQ?ID?NO.3所述的堿基序列，具體序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；

內引物1具有序列表中SEQ?ID?NO.4所述的堿基序列，具體序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；

內引物2具有序列表中SEQ?ID?NO.5所述的堿基序列，具體序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；

其中，所述的一對外引物與一對內引物的摩爾數之比為1：6～8。

設計的引物位于人DD3^PCA3基因外顯子3和外顯子4a中，具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的堿基序列，具體序列為：

AGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAAGCACAAAAGGAAGCACAGAGATCCCTGGGAGAAATGCCCGGCCGCCATCTTGGGTCATCGATGAGCCTCGCCCTGTGCCTGGTCCCGCTTGTGAGGGAAGGACATTAGAAAATGAATTGATGTGTTCCTTAAAGGATG。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：一種人前列腺癌特異基因DD3^PCA3定性檢測試劑盒，其特征在于：由一套引物、10倍環介導等溫擴增反應緩沖液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照、逆轉錄酶和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對外引物和一對內引物組成，其序列分別如下所示：

所述引物包括2條外引物和2條內引物，其序列分別如下：