[發(fā)明專利]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)人前列腺癌特異基因DD3PCA3試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810244722.6
• 申請(qǐng)日: 2008-11-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101423873A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱斌;賈瑞鵬;葛海燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陶海鋒

1.一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)人前列腺癌特異基因DD3^PCA3的引物，其特征在于：由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列分別如下所示：

外引物1具有序列表中SEQ?ID?NO.2所述的堿基序列，具體序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；

外引物2具有序列表中SEQ?ID?NO.3所述的堿基序列，具體序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；

內(nèi)引物1具有序列表中SEQ?ID?NO.4所述的堿基序列，具體序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；

內(nèi)引物2具有序列表中SEQ?ID?NO.5所述的堿基序列，具體序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；

其中，所述的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1：6～8。

2.一種人前列腺癌特異基因DD3^PCA3定性檢測(cè)試劑盒，其特征在于：由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、逆轉(zhuǎn)錄酶和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物組成，其序列分別如下所示：

所述引物包括2條外引物和2條內(nèi)引物，其序列分別如下：

外引物1具有序列表中SEQ?ID?NO.2所述的堿基序列，具體序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；

外引物2具有序列表中SEQ?ID?NO.3所述的堿基序列，具體序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；

內(nèi)引物1具有序列表中SEQ?ID?NO.4所述的堿基序列，具體序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；

內(nèi)引物2具有序列表中SEQ?ID?NO.5所述的堿基序列，具體序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；

其中，所述的一對(duì)外引物與一對(duì)內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1：6～8；所述DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst?DNA聚合酶，活力為8個(gè)活性單位/微升；所述陽(yáng)性對(duì)照為含人前列腺癌特異基因DD3^PCA3cDNA的樣品；陰性對(duì)照為雙蒸水；所述逆轉(zhuǎn)錄酶采用鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，活力為10個(gè)活性單位/微升；所述顯色劑為20×SYBR?Green?I。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人前列腺癌特異基因DD3^PCA3定性檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液由200mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、40～100mM硫酸鎂、4～10M甜菜堿、5～10mM的dNTPs和1％的質(zhì)量百分濃度的曲拉通X-100組成。

4.權(quán)利要求2所述試劑盒定性檢測(cè)人前列腺癌特異基因DD3^PCA3的檢測(cè)方法，具體包括以下步驟：

(1)常規(guī)方法提取組織、血液或尿液中的RNA；

(2)配置擴(kuò)增體系，在每25μl擴(kuò)增體系中，含外引物5pmol，內(nèi)引物30～40pmol，10倍環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液2.5μl，步驟(1)中RNA提取液2～5μl，1μl的Bst酶，0.1μl鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，其余為水；60～65℃恒溫反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后加1μl顯色劑，于紫外燈下觀察，顏色變?yōu)榫G色說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。