[發明專利]一種α-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達

無效

• 申請號: 200810244467.5
• 申請日: 2008-12-05
• 公開（公告）號: CN101434943A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 陳堅;吳敬;童星
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種α-葡萄糖苷酶(簡稱AGLU酶)基因的克隆與表達，本發明屬于酶基因工程和酶工程領域。具體地說涉及一種編碼黑曲霉(Aspergillus?niger)WX-07AGLU酶的DNA序列及其表達。

背景技術

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，簡稱AGLU酶，EC?3.2.1.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以從低聚糖的非還原末端切割α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，并將游離的葡萄糖基以α-1，6糖苷鍵形式轉移到其他糖底物上，形成具有非發酵性的功能性低聚糖——低聚異麥芽糖(簡稱IMOs，主要包括異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖等)。低聚異麥芽糖是一類含有至少一個α-(1，6)糖苷鍵的低聚糖，主要是異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖，天然少量存在于醬油，蜂蜜中，它已經慢慢被用來替代傳統的蔗糖作為食品添加劑。它被攝入人體后不會被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被腸道的益生菌如雙歧桿菌作為碳源利用，故其具有良好的雙歧因子作用，可以改善人體腸道的功能。此外，由于低聚異麥芽糖的甜度只有普通糖的一半，可以有效防止兒童齲齒，適宜糖尿病人食用，可以作為飲料糖果和保健品的添加劑。在飼料工業中，低聚異麥芽糖被認為可以在提高家禽存活率的同時，又不會存在合成飼料帶來對人體的副作用，據報道，日本50％左右的飼料中都含有低聚異麥芽糖。目前，低聚異麥芽糖已經在食品、醫藥和飼料加工行業有了很廣泛的應用。

生產AGLU酶的微生物種類有細菌、曲霉、古細菌等。現在工業上生產環糊精所使用的AGLU酶主要來自黑曲霉。

目前，黑曲霉的AGLU酶的編碼基因(aglu基因)得到了克隆，但是成功的都是采用曲霉屬作為宿主。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生產能力普遍較低，為了克服野生菌株的低生產能力，國內外研究者通過構建基因工程菌生產重組AGLU酶。在國內，對α-葡萄糖苷酶的研究還主要在α-葡萄糖苷酶的生產菌種選育和酶學性質方面，雖然有通過RT-PCR方法擴增得到A.nigerα-葡萄糖苷酶cDNA，構建重組質粒并嘗試在大腸桿菌中表達，但酶表達量偏低，而且重組蛋白是胞內酶，分離純化的成本相對高。

迄今為止，國內生產低聚異麥芽糖用α-葡萄糖苷酶主要依賴日本進口，為了降低低聚異麥芽糖的商業成本，首先必須降低α-葡萄糖苷酶的生產成本。Aspergillus?niger是最常用的α-葡萄糖苷酶的生產菌株，但同樣存在生產能力較低的缺陷。在國內的報道中，重組α-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中一般定位于胞內形成包涵體或存在于周質中，不利于重組α-葡萄糖苷酶的回收與使用。因此，構建重組菌大規模生產胞外α-葡萄糖苷酶，對降低α-葡萄糖苷酶的生產成本顯得非常重要。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種α-葡萄糖苷酶，其具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。本發明的另一個目的是提供一種編碼該α-葡萄糖苷酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

本發明的再一個目的是提供包含本發明基因的表達宿主細胞。

本發明的技術方案：一種α-葡萄糖苷酶，縮寫為AGLU酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

所述的α-葡萄糖苷酶的基因，縮寫為aglu基因，其核苷酸序列如SEQ?IDNO：1所示。

所述的aglu基因的表達方法：由黑曲霉(Aspergillus?niger)WX-07總DNA獲得aglu的cDNA?SEQ?ID?NO：1，aglu基因以質粒pPIC?9K為表達載體，以畢赤酵母KM?71為表達宿主，實現aglu基因的可溶性表達；

(1)黑曲霉(Aspergillus?niger)WX-07總DNA的提取：