[發明專利]一種α-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達

無效

• 申請號: 200810244467.5
• 申請日: 2008-12-05
• 公開（公告）號: CN101434943A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 陳堅;吳敬;童星
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種α-葡萄糖苷酶基因的表達方法，其特征是由黑曲霉WX-07總DNA獲得aglu的cDNA?SEQ?ID?NO：1，aglu基因以質粒pPIC9K為表達載體，以畢赤酵母KM71為表達宿主，實現aglu基因的可溶性表達；

(1)黑曲霉WX-07總DNA的提取：

黑曲霉WX-07菌株在YPD液體培養基中培養2天，菌絲體過濾，再用無菌水沖洗三次，用無菌濾紙吸干水分，將菌絲體轉入研缽內，加液氮研磨得菌粉，將菌粉放入事先稱重的50mL離心管中，稱量1g菌粉，將由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸鈉、10mL?500mmoL/L?EDTA、5mL?1mol/L?Tris-HCl緩沖液加水定容到100mL組成的抽提緩沖液在65℃水浴中預熱，按3mL/g菌粉加入抽提緩沖液，用封口膜封住，65℃放置1h，得菌液；吸取1.5mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中，平行2管，10000r/min離心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL離心管中，加入0.75mL由50mL?10％CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mL?1mol/L?Tris-HCl定容到100mL的5×CTAB溶液，然后再每管分成兩管，每管取0.6mL，分別加入0.6mL的酚/氯仿/異戊醇體積比25∶24∶1混合溶液，混勻，10000r/min離心10min；上清液吸入另一批新的離心管中，棄下層油相及中層蛋白；在這批離心管中分別加入等體積、0.4mL氯仿/異戊醇體積比24∶1混合溶液，顛倒混勻，10000r/min離心10min，吸取上清，重復以上步驟，直至無蛋白；加入等體積0.3mL異丙醇至上清液中，充分混勻，-20℃過夜，第二天，10000r/min，棄上清；用現配的70％的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用無水乙醇洗沉淀1次，倒掉乙醇，室溫干燥20-30min；加50μL無菌水溶解沉淀，-20℃凍存；

(2)α-葡萄糖苷酶編碼基因的克隆：

以黑曲霉WX-07總DNA為模板，由于aglu基因是有四個外顯子和三個內含子，所以通過PCR和over-lap?PCR擴增出aglu基因，以下列八個核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點Not?I：

引物1：5’-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3’

引物2：5’-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3’

引物3：5’-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA-3’

引物4：5’-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3’

引物5：5’-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3’

引物6：5’-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC-3’

引物7：5’-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3’

引物8：5’-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3’?

第一輪PCR：

以黑曲霉WX-07總DNA為模板，分別以P1、P2；P3、P4；P5、P6；P7、P8為上下游引物，擴增出exon?1，exon?2，exon?3，exon?4；

PCR反應在50μL體系中進行：5×PCR緩沖液10μL，2.5mmol/L?dNTPs?4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA?1μL，Taq酶0.5μL，加雙蒸水至總體系50μL；

PCR反應條件為：在94℃變性4min后開始循環，然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃分別延伸1min、1min、1min和3min，共35個循環后，再于72℃延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37℃培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8～10h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；

第二輪PCR：

以exon?2和exon?3為模板，以P3、P6為上下游引物，擴增得到exon?2-3；

PCR反應在50μL體系中進行：5×PCR緩沖液10μL，2.5mmol/L?dNTPs?4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon?2和exon?3各1μL，Taq酶0.5μL，加雙蒸水至總體系50μL；

PCR反應條件為：在94℃變性4min后開始循環，然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環后，再于72℃延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-T?simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37℃培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8～10h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；

第三輪PCR：

以exon?2-3和exon?4為模板，以P3、P8為上下游引物，擴增得到exon?2-3-4；

PCR反應在50μL體系中進行：5×PCR緩沖液10μL，2.5mmol/L?dNTPs?4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon?2-3和exon?4各1μL，Taq酶0.5μL，加雙蒸水至總體系50μL；

PCR反應條件為：在94℃變性4min后開始循環，然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共35個循環后，再于72℃延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-T?simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37℃培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8～10h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；

第四輪PCR：?

以exon?1和exon?2-3-4為模板，以P1、P8為上下游引物，擴增得到exon1-2-3-4；

PCR反應在50μL體系中進行：5×PCR緩沖液10μL，2.5mmol/L?dNTPs?4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，exon?1和exon?2-3-4各1μL，Taq酶0.5μL，加雙蒸水至總體系50μL；

PCR反應條件為：在94℃變性4min后開始循環，然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35個循環后，再于72℃延伸10min，擴增得到全基因exon?1-2-3-4片段2880bp，割膠回收，回收片斷與pMD18-T?simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37℃培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8～10h后提取質粒，命名為aglu/pMD18-T?simple，將此質粒進行序列測定；

(3)aglu基因在表達載體上的構建：

用于構建表達載體的質粒是pPIC?9K，帶有α-Factor信號肽，將pPIC?9K質粒和擴增的aglu基因進行Not?I酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶16℃連接過夜，連接產物轉化E.coli?JM109感受態細胞，經37℃培養過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板進行液體培養，然后抽提質粒，得到富集的aglu/pPIC?9K質粒；

(4)畢赤酵母菌KM71轉化和篩選重組菌：

將表達載體aglu/pPIC?9K?17μL，10×H?buffer?2μL，Bgl?II?1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的條帶，溶于20μL無菌水中，得到線性化的DNA；

在80μL畢赤酵母KM71感受態細胞中加入2μL線性化的DNA，混勻，轉入1mm預冷的電轉杯中，將電轉化儀調至畢赤酵母檔，電激，轉化物中加入1mL1mol/L的山梨醇，30℃溫育1h，取200μL的山梨醇重懸液涂布MD平板，30℃培養72小時；挑取回復突變菌株接種于YPD/G418平板上，30℃培養48h至長出單菌落，為獲得多拷貝的aglu基因的菌株，G418濃度篩選梯度依次為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL；

pPIC?9K空質粒同上處理，所得轉化菌作為陰性對照；

(5)重組畢赤酵母KM?71/aglu/pPIC?9K的PCR鑒定：

選取含4mg/mL?G418的YPD/G418上單菌落，以引物1，引物8作為引物，用前述的PCR方法，檢驗是否能夠擴增得到全長exon?1-2-3-4片段；重組畢赤酵母KM?71/pPIC9K的PCR鑒定作為對照；鑒定后獲得正確的重組畢赤酵母KM71/aglu/pPIC?9K用于后續實驗；

(6)重組畢赤酵母的培養：

將鑒定正確的單菌落KM?71/aglu/pPIC?9K接種至10mL?YPD培養基，30℃培養24h，1mL培養液接入50mL?BMGY，30℃培養24h，至OD為4.0，離?心收集菌體，用25mL?BMMY培養基重懸培養，甲醇誘導表達，分別于24h、48h、72h和96h取樣，每次取樣200μL，離心收集上清，并補加250μL甲醇至終濃度1％；陰性對照重組畢赤酵母KM?71/pPIC9K培養方法同上；

(7)重組α-葡萄糖苷酶的檢測：

SDS-PAGE檢測表達產物在98kDa和33kDa有條帶，收集畢赤酵母發酵培養的上清液，硫酸銨沉淀，透析，制成粗酶液，測定酶活方法如下：用pH?5的醋酸鈉緩沖液配制10％的麥芽糖溶液10mL，加50μL粗制的濃縮酶液，60℃反應24h，然后煮沸2min，微孔過濾，HPLC檢測產物，與市售的低聚異麥芽糖產品IMO-900比較各成分組成；液相檢測顯示有轉糖苷產物異麥芽糖、潘糖生成。?