[發(fā)明專(zhuān)利]腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810244275.4
• 申請(qǐng)日: 2008-12-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101750381A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王爾中
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/31;G01N21/17;G01N33/48;C12Q1/26
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。

腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是：腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H₂O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH₄⁺)，此反映過(guò)程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過(guò)測(cè)定此波長(zhǎng)處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無(wú)法用一般醫(yī)院的可見(jiàn)光分析儀測(cè)定，而需要使用專(zhuān)門(mén)的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric?Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法如下：

腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨

氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca²⁺亞硝酸+

??????????????????????????????????6亞鐵細(xì)胞色素c

亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶

這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶(Adenosine?Deaminase；EC?3.5.4.4)酶(偶)聯(lián)亞硝酸還原酶(nitrite?reductase；EC?1.7.2.2)、硝酸還原酶(nitrate?reductase；EC1.7.1.1；EC?1.7.1.2；EC?1.7.99.4)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應(yīng)產(chǎn)生氨，再通過(guò)(偶)聯(lián)合亞硝酸還原酶、硝酸還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。

實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為理想：

緩沖液??????????????????????100mmol/L

穩(wěn)定劑??????????????????????500mmol/L

輔酶????????????????????????3mmol/L

亞硝酸還原酶????????????????6000U/L

硝酸還原酶??????????????????8000U/L

腺苷????????????????????????4mmol/L

高鐵細(xì)胞色素C???????????????6mmol/L

氯化鈣????????????????????3mmol/L

鈣離子是亞硝酸還原酶的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。

本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)可以是單劑，包括：

緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。

試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1

緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。

試劑2

緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。

輔酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑：

試劑1