[發明專利]一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法

有效

• 申請號: 200810243725.8
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號: CN101424692A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發明（設計）人: 李軍;黃祖瑚;韓亞萍;劉源;邢益平;萬玉峰;孔練花;周東輝;盧山
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學第一附屬醫院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/576
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

1.一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，其特征在于，用 HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分別與不同 熒光素標記的主要組織相容性復合物－抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠 抗人CD8單克隆抗體共孵育；孵育次序依次為：先將熒光素標記的主要組織相容性復合 物－抗原肽五聚體與外周血共孵育適當時間，離心，棄去上清，洗滌后再加入熒光素標 記的小鼠抗人CD3單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆共孵育適當時間，經裂解紅細胞、 離心洗滌、固定細胞后，在流式細胞儀上利用CD3設門技術，定量檢測乙型肝炎病毒特 異性細胞毒性T淋巴細胞；

其中熒光素標記采用如下方式：主要組織相容性復合物－抗原肽五聚體采用藻紅蛋 白PE標記，小鼠抗人CD3單克隆抗體采用葉綠素蛋白偶聯物PerCP?CY5.5標記，小鼠 抗人CD8單克隆抗體采用別藻藍蛋白APC標記；

采用HLA-A0201型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復合物－抗原肽五聚 體采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體，其氨基酸序列為Phe?Leu?Pro?Ser?Asp?Phe?Phe? Pro?Ser?Val；采用HLA-A2402型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復合物－抗 原肽五聚體采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體，其氨基酸序列為Glu?Tyr?Leu?Val? Ser?Phe?Gly?Val?Trp。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于共孵育溫度均為22-25℃，孵育時間為 20min，避光反應。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于洗滌液采用pH為7.2含0.1％(w/v)的 牛血清白蛋白的PBS。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于設門是采用以下方式進行的：根據流式 細胞儀的前向散射光和側向散射光雙參數點圖，設R1“門”圈出樣本中淋巴細胞群體， 再設R2“門”圈出R1門中CD3陽性的群體，目的是將檢測細胞的范圍縮小到T淋巴細 胞，而不是整個的外周血單個核細胞或所有的淋巴細胞，用CellQuest軟件定量分析MHC- 抗原肽五聚體-PE及CD8－APC雙陽性細胞的百分率，即為乙型肝炎病毒特異性細胞毒 性T淋巴細胞的檢測頻數。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于要求在細胞固定后的3h-20h之間的時 間范圍內進行流式細胞儀檢測，并獲取30萬個細胞，以保證檢測結果的準確性。

6.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于以T淋巴細胞設門，計算R2“門” 內MHC-抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細胞數，HLA-A0201陽性HBV感染者檢測HBcAg 18-27MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細胞為其特異細胞毒性T淋巴細胞頻數， HLA-A2402陽性HBV感染者檢測HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的 細胞為其特異性細胞毒性T淋巴細胞頻數；特異細胞毒性T淋巴細胞率(％)＝MHC抗 原肽五聚體和CD8雙陽性的細胞數除以CD8陽性細胞數×100％。