[發(fā)明專利]一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產(chǎn)量的啟動子置換方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810243721.X
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號: CN101475944A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設計）人: 陸兆新;孫會剛;別小妹;呂鳳霞;烏云達來;盧亞萍;王煜;曹林
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/11;C12N1/21;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/07
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

一、技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產(chǎn)量的啟動子置換方法，是利用啟動子置換技術(shù)提高淀粉液化芽孢桿菌的脂肽類抗生素fengycin產(chǎn)量方法，屬于生物技術(shù)領域。?

二、背景技術(shù)

【文摘】1968年Arima(Biochemical?and?Biophysical?Research?Communication，1968，31：488-496.)等首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)能夠產(chǎn)生抗菌脂肽surfactin以來，抗菌脂肽產(chǎn)生菌的篩選主要集中在枯草芽孢桿菌的不同菌株之間(中國農(nóng)業(yè)科學，2003，(12)：1496-1501.微生物學報，2003，43(5)：647-652.)。近年來，進一步的研究表明，除枯草芽孢桿菌外，淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)(Phytichemistry，2002，61：693-698.)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)(Journal?of?Fermentation?andBioengineering，1992，74：255-216)等也能產(chǎn)生抗菌脂肽。?

抗菌脂肽一般是革蘭氏陽性芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物?？咕牡姆肿邮怯捎H水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結(jié)構(gòu)，【文摘】抗菌脂肽除了具有抗菌活性之外還具有生物表面活性劑的特性(MolecularMicrobiology，2005，56：845-857.精細化工，2006，(2)：121-125.)，在醫(yī)藥(AppliedMicrobiology?and?Biotechnology，1999，51(5)：553-563.The?Journal?of?Antibiotics，1986，39：755-761)、農(nóng)業(yè)(Phytichemistry，2002，61：693-698)、食品及化妝品(食品工業(yè)科技，2006，4：91-93.]、石油開采(微生物學雜志，2005，2：4-8農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2004，(3)：330-333.)和環(huán)境治理(Journal?of?hazardous?materials，2001，85(1-2)：111-125)等領域有重要的應用前景，已引起廣泛的關注。?

其中fengycin等抗菌脂肽具有強烈的抗絲狀霉菌作用，已有許多用來抑制植物病原菌的研究實例。因此，fengycin在植物病害生物防治方面具有重要的應用前景。對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。?

但是，通常的菌株一般抗菌肽產(chǎn)量很低，迄今為止，脂肽產(chǎn)生菌的產(chǎn)量一般低于1.0g/L，少的甚至在0.1g/L以下，因此，需要對生產(chǎn)菌株進行誘變，在這方面已有少量嘗試，并取得了良好效果(Journal?ofNatural?Products，2002，63：1492-1496)。此外，隨著對抗菌脂肽的合成機理的認識和合成酶基因的定位、克隆和表達的成功，人們開始采用基因工程的手段構(gòu)建基因工程菌株用于抗菌脂肽的生產(chǎn)(中國農(nóng)業(yè)科學，2003，(12)：1496-1501)。?

同源整合技術(shù)就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因為目的的一項技術(shù)。它克服了隨機整合的盲目性和危險性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。這項術(shù)的誕生可以說是分子生物學技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、可誘導性基因同源整合系統(tǒng)的建立，使得對基因靶位點在時間和空間上的調(diào)控更加精確。【文摘】(APPLIED?ANDENVIRONMENTAL?MICROBIOLOGY，Aug.2005，p.4577-4584.J.Bacteriol.183：6265-6273.)。目前已有通過同源整合技術(shù)使強啟動子來置換抗菌肽合成酶操縱子的啟動子，并提高了該抗菌肽的產(chǎn)量。?

三、發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題?

本發(fā)明的目的是通過分子生物方法提高fengycin合成酶基因簇的表達，獲得fengycin產(chǎn)量提高的淀粉液化芽孢桿菌置換菌株。?

技術(shù)方案?

一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產(chǎn)量的啟動子置換方法，是將野生型淀粉液化芽孢桿菌ES-2的fengycin合成酶基因的啟動子Ppps置換為啟動子P59的方法。其特征在于，?

1)啟動子P₅₉序列的克隆?

設計啟動子P₅₉的引物：?

上游引物：5’-ctttattgttttgccatt-3’?