[發明專利]一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法

無效

• 申請號: 200810243721.X
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號: CN101475944A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 陸兆新;孫會剛;別小妹;呂鳳霞;烏云達來;盧亞萍;王煜;曹林
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/11;C12N1/21;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/07
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

1.一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法，是將野生型淀粉液化芽孢桿菌ES-2的fengycin合成酶基因的啟動子Ppps置換為啟動子P59的方法，其特征在于，

1)啟動子P₅₉序列的克隆

設計啟動子P₅₉的引物：

上游引物：5’-ctttattgttttgccatt-3’

下游引物：5’-ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta-3’

采用上述引物并以質粒pHB201做為模板，擴增獲得一個長377bp的P₅₉啟動子序列；

2)fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆

設計淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5’端的DNA片段引物序列，

上游引物：5’-tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc-3’

下游引物：5’-ccaaacttcttgtctg-3’

以淀粉液化芽孢桿菌ES-2基因組DNA為模板，擴增獲得一個長450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQ?ID?NO.1，即淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5’端部分片段；

設計新霉素抗性基因的引物，

上游引物：5’-ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt-3’

下游引物：5’-ccggaattccggggcaatgaaattagactat-3’

從質粒pMK3擴增得到新霉素抗性基因片段1153bp；

3)同源整合載體的構建

將PCR產物分別純化后，通過SOE?PCR的方法將啟動子P₅₉DNA片段和fengycin合成酶基因同源片段連接到一起，ddH₂O重溶，與pMD19-T載體連接，得到質粒載體pMD19-T1，然后在質粒載體pMD19-T1的EcoRI位點加上新霉素抗性基因，得到質粒載體pMD19-T2，將pMD19-T2轉化大腸桿菌TOP10F’，獲得同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F’；

4)同源整合載體轉化淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2

將同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F’，提取同源整合載體質粒，轉化感受態淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2，獲得同源整合載體轉化的淀粉液化芽孢桿菌ES-2菌株，即啟動子P59置換的菌株。

2.權利要求1所述方法得到的置換菌株。

3.權利要求2所述置換菌株的鑒定方法，其特征在于：

設計引物：

上游引物：5’-ctttattgttttgccatt-3；?

下游引物：5’-ccaaacttcttcgtctg-3，

以啟動子P₅₉置換的菌株基因組DNA為模板，在100μl體系中，引物終濃度各為1μM，dNTPs終濃度為0.2mM，淀粉液化芽孢桿菌基因組DNA10ng，4U?pfu?DNA聚合酶；擴增程序為94℃2min；30個循環：94℃50s，53℃50s，72℃90s；72℃10min；

如果擴增得到大小826bp的DNA片段，即是啟動子P59片段和淀粉液化芽孢桿菌ES-2fengycin合成酶基因5’端部分DNA片段連接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢桿菌ES-2的基因組DNA中的DNA片段，即為啟動子P₅₉置換的菌株。?