[發明專利]用一類基于與組氨酸結合生成熒光基團的銥配合物標記抗體

無效

• 申請號: 200810242798.5
• 申請日: 2008-12-19
• 公開（公告）號: CN101750486A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 費浩;周明;賈俊麗;王小波;黃澤柱
• 申請（專利權）人: 蘇州納凱科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;C07K2/00;C07K16/00
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技術領域

該發明涉及一種新穎的生物標記方法，即通過一類自身無熒光的金屬銥配位化合物與蛋白質上的組氨酸殘基結合，形成可被激發的熒光基團，從而得以標記抗體分子，并用于免疫分析檢測、免疫熒光成像等生物技術領域。

背景技術

生物分子的熒光標記是應用生物技術中的重要組成部分，被熒光基團標記的生物分子如抗體、多肽及核酸等通過分子間相互作用，識別目標分子，后通過高靈敏的光學方法或電化學方法(光致發光、熒光共振能量轉移、時間分辨、電化學發光)獲取標記分子產生的信號，以此形成一系列基于熒光標記的檢測手段，被廣泛地應用于各種生命科學基礎研究、臨床醫學診斷、食品衛生安全等領域。常見的熒光標記物包括有機小分子(如羅丹明和熒光素等)、無機過渡金屬配位化合物(如三聯吡啶釕)，以及金屬和半導體納米顆粒(如量子點)等，這些材料可以通過化學修飾的手段，在其上引入可被活化的化學基團，通過共價交聯方式標記生物分子。

蛋白質和多肽的表面分布著大量較活潑的化學基團，例如α-氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、巰基(-SH)和羥基(-OH)等。其中，位于蛋白質N末端或賴氨酸殘基側鏈末端的α-氨基，以及位于半胱氨酸殘基側鏈末端的巰基最常被用于同標記化合物或交聯劑(crosslinker)交聯^【1】。同α-氨基發生反應的基團包括經過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化后的羧基，或者是其進一步與氮羥基琥珀酰亞胺(NHS)形成的較穩定的活性琥珀酰亞胺酯中間體，兩者皆可與氨基交聯形成穩定的肽鍵；另外，氨基也可以同異硫氰酸基團(-N＝C＝S)發生定量反應并以硫脲鍵進行交聯。同巰基發生反應的包括馬來酰亞胺基團，含有該基團的交聯劑可以與蛋白質上的巰基形成穩定的硫醚鍵。以上這些反應方式目前應用比較廣泛，有些需要在交聯基團的活化過程中添加額外的試劑，這就意味著需要更多的反應步驟和時間來完成標記；有些商業銷售的標記化合物則被預先活化以方便用戶，但這些化合物受到穩定性和反應條件的限制，不能長期保存。此外，在實際工作中，以上提到的標記基團的可選擇性比較有限，通常在被標記物中進行一種類型的標記(如-NH₂同-COOH或-SH的交聯反應)之后，即難以進行第二，以至第三種標記。

組氨酸由于其側鏈的咪唑基團上的兩個N原子各含有一對孤電子，因而具有較強的與二價金屬離子(如Zn++，Ni++，Cu++)的配位能力，這一特性在許多研究和應用中得到驗證。比如，人血液中存在有一種富組氨酸的糖蛋白(histidine-rich?glycoprotein，HRG)，在pH和Zn++濃度的調節下，HRG上組氨酸通過與Zn++的絡合，引起一系列蛋白結構的變化和信號轉導，最終引發細胞凋亡，抑制血管的生成^【2】。又如，6聯組氨酸序列(His₆)與Ni++的絡合能力被研究者開發成為一種使用極為廣泛的蛋白質表達純化手段，德國QIAGEN公司開發的用于純化和檢測His₆標簽蛋白的試劑盒，即利用了組氨酸與Ni-NTA可逆的高親和力相互作用^【3】。在此基礎上，通過在Ni-NTA上交聯熒光基團，His₆序列與Ni-NTA的高親和力也被發展用于His₆標簽蛋白的熒光標記，但所報道的這些標記基團在結合蛋白前后沒有熒光強度的改變，不僅需要序列中包含連續的6個組氨酸殘基，且熒光標記結構龐大，應用受到限制^{【4】【5】}。組氨酸與Cu++的絡合能力也被廣泛地研究，其中有研究者利用含共軛芳香環的化合物與銅離子結合，制備成為一種熒光探針，利用競爭置換法檢測溶液中游離的組氨酸，該方法雖然靈敏度較高，但從其反應原理上(置換法)無法進行多肽和蛋白質的標記^【6】。

本發明的特色是利用新型的過渡金屬銥配位化合物，直接地、特異性地標記多肽和蛋白質(抗體)中的單個組氨酸殘基，標記前后熒光強度大大增強，形成的熒光基團分子量小，標記過程簡單快速，形成的產物化學性質穩定，光學性質優良，可以廣泛用于免疫檢測、分子示蹤等領域。

發明內容

本發明是利用一類環金屬銥配位化合物，對抗體、多肽等蛋白質進行標記，發明內容包括標記過程與分析方法，以及標記產物用于進一步的生物分析。

兩個此類化合物的結構如式I所示。