[發明專利]水產品中副溶血弧菌的PCR-ELISA檢測方法

無效

• 申請號: 200810238409.1
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101434999A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 周德慶;趙峰;劉琦;柳淑芳;蘇來金;曹慧慧;馬麗萍
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司
• 代理人: 袁和善

技術領域：

本發明涉及水產品中微生物的安全檢測技術，是一種PCR-ELISA檢測并定量水產品中副溶血弧菌的方法。

背景技術：

副溶血弧菌是一種重要的食源性致病菌，主要存在于近海岸的海水、海水沉積物和魚類、貝類等海產品中，能引起急性腸胃炎和原發性敗血癥。1992年至2001年食源性疾病監測網(包括13個省份)的數據顯示，副溶血弧菌引起的疾病暴發率位居微生物性食源性疾病之首。另外副溶血弧菌，也是威脅海水養殖業的主要病原菌之一。

副溶血弧菌可產生多種溶血毒素，有熱穩定直接溶血素(Thermostabledirect?hemolysin，TDH)、熱不穩定溶血素(Thermolabile?hemolysin，TLH)和相對熱穩定直接溶血素(TDH-relatedhemolysin，TRH)。大量的流行病學研究表明，幾乎所有的臨床分離株都可產生神奈川現象(KP⁺)，即在特殊的血瓊脂培養基上菌落周圍有一條溶血環。這種現象是由分離株產生的TDH引起的，因而TDH被認為是該菌的一種主要的毒力因子，tdh基因可用于檢測致病性副溶血弧菌。日本科學家Hatsumi等于1985年研究發現無論是臨床分離株還是環境分離株都含有tlh基因，而且tlh基因具有種的特異性，可用于副溶血弧菌的定性檢測。

目前對副溶血弧菌的檢測主要有病原體分離法、普通PCR方法和熒光定量PCR方法。我國副溶血弧菌的檢測方法的國家標準GB/T4789.7-2008《食品衛生微生物學檢驗?副溶血性弧菌檢驗》和行業標準SN0173-1992《出口食品副溶血弧菌檢驗方法》均為病原體分離法，該類標準主要是傳統的培養及生化鑒定方法，檢測周期約5-7d。此方法檢測周期長、工作量大；1999年英國科學家Asim等人建立了一種普通PCR可檢測副溶血弧菌的方法，能同時檢測副溶血弧菌中的tlh、tdh、trh基因，但這一方法只能的定性檢測副溶血弧菌而不能進行定量分析；2003年美國科學家Geroge等人建立了一種熒光定量PCR檢測副溶血弧菌tdh基因的方法，該方法檢測靈敏度高，檢測速度快，可對副溶血弧菌進行定量分析，但該方法需購買昂貴的熒光定量PCR儀，而且檢測樣品費用高，不能滿足實際中大規模檢測的要求。隨著人們對海洋資源利用的日益關注，以及對食品安全的高度重視，建立一種快速、準確、特異、靈敏的副溶血弧菌檢測方法十分必要。

發明內容：

本發明目的是提供一個PCR-ELISA方法檢測副溶血弧菌，并鑒定其是否含有致病基因，提高檢測副溶血弧菌的速度和靈敏度，克服了定量檢測費用較高的缺點，適合水產品中副溶血弧菌高通量檢測。

本發明PCR-ELISA檢測并定量副溶血弧菌的方法是按以下實施步驟完成的：包括：1、DNA模板的制備；2、PCR反應；3、特異探針進行ELISA反應；4、結果的檢測。

1、DNA模板的制備：

a、待測標本無菌操作。貝類取含內臟的全部貝肉、魚類取魚體不同部位、甲殼類取包括鰓及腸的部分或整體。稱取待測標本25g，加入3.5％無菌NaCl溶液225mL，均質后，取10mL加入90mL改進堿性蛋白胨水(MAPW，將APW中NaCl濃度調至3.5％)中。置于37℃恒溫培養箱，120r/min增菌培養7h。

b、取1.0mL增菌后的細菌培養物，置于1.5mL離心管中，12000r/min離心5min，棄去上清液；加入100μL無菌水，漩渦混勻，100℃水浴10min，立即冰浴2min；12000r/min離心5min，取上清。

2、PCR反應：

a、配制30μL反應體系：包括PCR?Buffer(含有200mM?pH?8.4?Tris-HCl；200mM?KCl；100mM硫酸銨；15mM?MgCl₂)3μL、2.5mM?dNTP?2.5μL、地高辛標記的正向引物TLH-F(10μM)1.5μL、地高辛標記的正向引物TDH-F(10μM)1.5μL、反向引物TLH-R(10μM)1.5μL、反向引物(10μM)TDH-R1.5μL、Taq酶0.5μL、DNA模板1μL(其中標準品加1μL作為DNA模板，陰性對照加超純水1μL，樣品取上述制備的DNA作為模板)、加超純水補足30μL。其中兩對引物的靶基因分別為副溶血弧菌的tlh基因(GenBank登陸號：AY289609.1)和副溶血弧菌的tdh基因(GenBank登陸號：AY044113.1)，其中上游引物的5′端均用地高辛標記，引物序列分別為：

TLH-F：5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTG-3′，