[發明專利]水產品中副溶血弧菌的PCR-ELISA檢測方法

無效

• 申請號: 200810238409.1
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101434999A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 周德慶;趙峰;劉琦;柳淑芳;蘇來金;曹慧慧;馬麗萍
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司
• 代理人: 袁和善

1.一種水產品中副溶血弧菌的PCR-ELISA檢測方法，包括DNA模板的制備、PCR反應、特異探針進行ELISA反應和結果的檢測，其特征在于：

(1)、DNA模板的制備：

a、待測標本無菌操作：貝類取含內臟的全部貝肉、魚類取魚體不同部位、甲殼類取包括鰓及腸的部分或整體；稱取待測標本25g，加入3.5％無菌NaCl溶液225mL，均質后，取10mL加入90mLNaCl濃度3.5％的改進堿性蛋白胨水中，置于37℃恒溫培養箱，120r/min增菌培養7h；

b、取1.0mL增菌后的細菌培養物，置于1.5mL離心管中，12000r/min離心5min，棄去上清液，加入100μL無菌水，漩渦混勻，100℃水浴10min，立即冰浴2min，12000r/min離心5min，取上清；

(2)、PCR反應：

a、配制30μL反應體系：包括PCR?Buffer3μL其中含有200mM?pH?8.4Tris-HCl、200mM?KCl、100mM硫酸銨和15mM?MgCl₂，2.5mM?dNTP?2.5μL，5’端用地高辛標記了的tlh基因正向引物TLH-F濃度10μM?1.5μL，5’端用地高辛標記了的tdh基因正向引物TDH-F濃度10μM?1.5μL，tlh基因反向引物TLH-R濃度10μM?1.5μL，tdh基因反向引物TDH-R濃度10μM?1.5μL，Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，加超純水補足30μL，其中TLH-F和TLH-R的靶基因為副溶血弧菌的tlh基因，TDH-F和TDH-R的靶基因為副溶血弧菌的tdh基因，四條引物的序列如下：

TLH-F：5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTG-3′；

TLH-R：5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′；

TDH-F：5′-CTTCCATCTGTCCCTTTTCCT-3′；

TDH-R：5′-ATAGAACCTTCATCTTCACCA-3′；

b、混勻反應體系，PCR反應程序如下：94℃預變性10min；進入循環，94℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，共25個循環；循環結束后72℃延伸10min，冷卻至4℃備用；

(3)、特異探針進行ELISA反應；

a、在96孔酶標板中每孔加200μL終濃度為1mg/L的鏈親和素溶液，4℃過夜，取出后棄去孔中的液體，每孔加200μL?pH?7.4的PBS緩沖液，洗滌4次，每次都甩干；

b、取PCR反應產物5μL于2個新的離心管中，一管加入5μL濃度10μM5’端用生物素標記了的tlh基因探針TLH-probe，另一管加入5μL濃度10μM5’端用生物素標記了的tdh基因探針TDH-probe，混合均勻，放入PCR儀中，94℃變性10min，56℃退火7min，各管中迅速加入200μL?pH?7.4的PBS緩沖液；其中TLH-probe的靶基因為副溶血弧菌的tlh基因，TDH-probe的靶基因為副溶血弧菌tdh基因，兩條探針的序列如下：

TLH-probe：5′-TAGCGGTGAGTTGCTGTTGTTGGATGCGT-3′；

TDH-probe：5′-GAATGTTGAAGTTGTACTTGACCT-3′：

c、取200μL上述反應液加入到包被好的96孔酶標板中，37℃溫浴30min，用PBST溶液洗滌4次，每次都甩干，其中PBST溶液為含有0.1％Tween-20的PBS緩沖液；

d、每孔加入已用PBS緩沖液1∶5000稀釋的200μLAnti-Dignxigenin-AP，Fab?fragments，37℃溫浴1h，用PBST溶液洗滌4次，每次都甩干；

e、每孔中加入200μL顯色底物溶液，37℃溫浴30min，其中顯色底物溶液為0.1M二乙醇胺緩沖液、1mM?MgCl₂和10mM?pNPP；

(4)、結果的檢測：

a、定性檢測：可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，tlh基因或tdh基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調零，在405nm處測定各孔的吸光值，OD₄₀₅大于等于0.1為陽性，小于0.1為陰性；

b、定量檢測：用酶標儀測得標準品和檢測樣品的OD值，根據已知標準品的不同濃度和這些標準品經過PCR-ELISA方法后測得的OD值繪制標準曲線，將陽性樣品檢測的OD值，代入標準曲線公式計算；

所述的標準品為載體，載體大小3142bp，載體中包括GeneBank登陸號為AY289609.1的tlh基因位點781到位點1230之間的450bp的一段序列，其中該標準品含有tlh的基因序列為：

5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGACGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCTCAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACGACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGACTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC-3′。