[發明專利]聯用磁分離與色譜分析測定混合物中配體親和力的方法

無效

• 申請號: 200810237298.2
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101620205A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 廖飛;楊曉蘭;謝燕玲;鄧萍;趙運勝;朱莎;甘志勇;廖娟;劉冬;于明安
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N30/00
• 分類號: G01N30/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明的技術領域

本發明涉及利用恰當的參考配體與樣品混合物制備成測定前樣品，在液相啟動測定前樣 品中各配體競爭結合蛋白上相同活性位點，然后用功能化的磁性納米材料以磁力回收蛋白-配 體復合物，變性復合物中的蛋白并提取所有結合的配體，用完全相同的色譜條件同步定性鑒 定和定量測定磁分離后提取的混合物中結合配體和測定前樣品中各種配體的色譜峰面積或峰 高，在優化條件下利用近似公式推算候選配體相對于參考配體的相對親和力的方法；此方法 可用于快速鑒定混合物中針對蛋白上特定位點的高親和力配體，可用于藥物篩選、高選擇性 探針篩選、抗原表位篩選等生物醫藥的基礎與應用領域。

發明的技術背景

高親和力且高特異性配體廣泛用作臨床藥物和工具，故測定配體同蛋白的親和力是生物 醫藥領域的基本工作之一。目前測定配體與蛋白親和力最常用方法依賴于候選配體與參考配 體競爭結合，但需分離出結合的參考配體并定量。為了便于定量測定結合的參考配體量，常 用特殊的信號標記參考配體，典型的為放射性同位素標記。顯然，同位素標記危害大，操作 不方便。更重要的是，目前常用方法測定配體親和力都需高純度候選配體樣品和高純度參考 配體，這無疑增加了發現所需高親和力配體的成本而效率卻極低。另一方面，篩選組合化學 庫已成為發現高親和力配體的關鍵技術，常規的高通量篩選技術都需要純樣品，這對于應用 組合化學技術是最大成本限制；而從天然產物中制備純樣品不僅成本高而效率低，更容易丟 失高親和力微量配體。因此，需以混合物為樣品且盡可能不用同位素標記的分析技術，從而 快速簡便測定混合物中特定配體或多個預期配體的親和力，降低制備樣品的成本且提高樣品 制備的效率，使組合化學技術能成為高親和力配體發現的常規技術。

目前，主要有三類技術可用混合物為樣品定量測定其所含配體的親和力，它們分別是 Schriemer等建立的前線親和色譜(Angew.Chem.Int.Ed.1998，37，3383-3387)、Von?Breeman 等建立的超濾-液相色譜-MS技術(Anal.Chem.2000，72，3853-3859；Mass?Spectrom.Rev.2002， 21，76-86.和Anal.Chem.2007，79，9398-402.)、Annis等建立的親和選擇-分子體積排阻-液相 色譜-MS-技術(J.Am.Chem.Soc.2004，126，15495-15503；Anal.Chem.2007，79，4538-4542 和Curr.Opin.Chem.Biol.2007，11，518-526)。但是它們在應用中仍然受到很大限制。前線親 和色譜技術必需親和柱，其制備成本高；所用配體混合物中不同配體含量的波動范圍有限； 難以可靠鑒定配體的特異性。超濾-液相色譜-MS聯用技術的分析效率很低，不適宜于大量樣 品快速測定，且定量測定重復性較低。親和選擇-分子體積排阻-液相色譜-MS-技術需特殊裝 置連接分子體積排阻系統與LC-MS系統，需用大量的參考配體，分析測定工作量也較大。

另外，von?Breeman等還建立了通過將蛋白固定化在磁性納米材料表面，用于對混合物中 不同配體快速鑒定，但是他們建立的此技術不能定量測定混合物中不同配體的親和力(Comb. Chem.High?Throughput?Screen?2008，11，1-6)。

發明內容

本發明以功能化磁性納米材料回收蛋白-配體復合物為基礎，利用非標記參考配體和候選 配體的競爭結合，以及色譜分析定性和定量，從而用近似公式推算候選配體的相對親和力。

1.本發明的技術方案在實施中涉及如下的特征性步驟(圖1)：

(1)以合成的未純化產物混合物、組合合成產物混合物、天然產物混合物為樣品；

(2)選擇符合要求的內源配體為參考配體使樣品直接為測定前樣品，或選擇恰當的 外源配體并將其優化量加入樣品混合物中得到測定前樣品；

(3)選擇所需功能化磁性納米材料；可將蛋白直接或間接固定化在磁性納米材料表 面以備經磁力回收蛋白與配體復合物，或在競爭結合體系達到平衡后加入以通 過磁力回收蛋白-配體復合物；

(4)在恒溫的緩沖體系加入優化量的相應蛋白和適量測定前樣品，混勻啟動來自測 定前樣品中各配體對蛋白上相同活性位點的競爭結合直到平衡；所用蛋白量和 測定前樣品量須優化以保障滿足定量測定親和力所要求的條件；