[發明專利]聯用磁分離與色譜分析測定混合物中配體親和力的方法

無效

• 申請號: 200810237298.2
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101620205A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 廖飛;楊曉蘭;謝燕玲;鄧萍;趙運勝;朱莎;甘志勇;廖娟;劉冬;于明安
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N30/00
• 分類號: G01N30/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種推算混合物中候選配體相對親和力的方法，該方法的特征是以混合物為樣品，選用恰當參考配體，經配體競爭結合蛋白上相同活性位點達到平衡，磁力回收蛋白-配體復合物，變性復合物中蛋白并提取所結合配體，色譜分析同步定性鑒定和定量測定參考與候選配體峰面積或峰高，在優化條件下從所得峰面積或峰高推算候選配體的相對親和力，其實施步驟包括：

(一)、以混合物為樣品，選擇符合要求的內源性配體為參考配體使樣品直接作為測定前樣品，或選用符合要求的外源性配體為參考配體，并將適量的外源性參考配體加入樣品混合物中得到測定前樣品；選用的參考配體有如下特征：

(1)所選參考配體與需測定相對親和力的候選配體在色譜分析時能被同步定量；

(2)對成分復雜的樣品可用不同理化性質參考配體進行多次測定，以便確定不同理化性質候選配體的相對親和力；

(3)可選用樣品中的特定配體為內源性參考配體，此時樣品本身為測定前樣品；如選用外源性參考配體則需將外源性參考配體加入樣品中先混勻作為測定前樣品；

(4)測定前樣品中所需外源性參考配體量取決于結合反應體系的蛋白量，需保障在所用蛋白量下無候選配體競爭結合時此外源性參考配體結合率仍低于20％；同時需優化測定前樣品用量以保障來自測定前樣品的各配體結合率都低于20％；如用內源性配體為參考，則來自測定前樣品的各配體結合率也需都低于20％；

(二)在恒溫的緩沖體系加入適量的相應蛋白和適量的測定前樣品，混勻后啟動測定前樣品中各配體對蛋白上相同活性位點的競爭結合直到達到平衡；

(三)經磁力物理分離回收蛋白與配體復合物，洗滌去除非特異性結合的物質；

(四)變性復合物中蛋白以提取所結合配體，措施包括加熱變性蛋白后用有機溶劑或緩沖液提取所結合配體、直接用有機溶劑提取所結合配體、用有機溶劑加熱變性蛋白并提取所結合配體；將所得結合配體適當濃縮；

(五)用完全相同色譜系統，分別分析測定前樣品和磁分離后提取的所結合配體混合物，同步定性鑒定和定量測定各配體色譜峰面積或峰高；對所用色譜系統要求如下：

(1)對測定前樣品和所提取結合配體混合物，所用色譜分析條件必須完全相同；

(2)據需測定親和力配體的性質選擇和優化色譜系統以保障分辯率和靈敏度；

(3)在配體混合物組成足夠簡單時可用高效液相色譜結合紫外吸收檢測分析；?

(4)在候選與參考配體都有良好揮發性時可用氣相色譜進行分析；

(5)可保障靈敏度和分辯率的毛細管電泳色譜分析系統也可用；

(6)對組成復雜樣品用質譜檢測器；

(六)優化步驟(一)中加入的參考配體量、步驟(二)中加入的相應蛋白量和測定前樣品量以及步驟(四)中所得結合配體在色譜分析前的稀釋或濃縮比例；在滿足所有條件后，可據測定前樣品中各配體色譜峰面積或峰高、磁分離后所得各結合配體色譜峰面積或峰高、各配體回收率，用如下的近似公式計算候選配體相對親和力；設定下列符號以推導用色譜定量指標計算相對親和力的近似公式：

A_TB：測定前樣品加入競爭結合體系后參考配體定量指標，用色譜峰面積為代表；

A_TX：測定前樣品加入競爭結合體系后候選配體X定量指標，用峰面積為代表；

A_BB：結合配體混合物中參考配體定量指標；?????RR_B：參考配體的回收率；

A_BX：結合配體混合物中候選配體X定量指標；????RR_X：候選配體X的回收率；

I_B：參考配體色譜定量線性響應曲線的截距；????K_B：參考配體的解離常數；

I_X：候選配體色譜定量線性響應曲線的截距；????K_X：候選配體X的解離常數；

P_f：達到平衡后競爭結合反應體系未被結合的蛋白位點濃度；

N：提取的結合配體混合物相對于競爭反應體系的濃縮比例；

在液相體系結合反應體系達到平衡后所生成的蛋白與任一配體的復合物量應符合質量作用定律，故對參考配體和任一候選配體X下述兩個關系式可成立：

因候選配體與參考配體競爭結合相同位點，則上述兩個關系式中的游離未結合位點濃度，即P_f，為同一個物理量，故候選配體與參考配體的相對親和力可表示如下：

各配體色譜定量指標都高于其線性響應曲線截距5倍，則相對親和力可近似為：

各配體結合率都低于20％，則相對親和力可進一步近似如下：?

計算相對親和力只需相對定量指標；如參考配體親和力已知，則此方法可測定候選配體解離常數；當比較不同混合物樣品中不同配體的親和力時，如用相同參考配體則其親和力可未知，如用不同參考配體則需已知它們的相對親和力。