[發明專利]誘導胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200810237002.7
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101445809A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發明（設計）人: 鄧偉;李正國;楊迎武;羅克明;金凱
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/31;A01H1/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

1.誘導胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達載體，其特征在于：所述植物雙元表達載體為pLFFLPBBM，所述pLFFLPBBM是在載體pBIN19的EcoRI和NheI酶切位點之間插入BBM基因和FLP-FRT位點特異性重組系統，所述FLP-FRT位點特異性重組系統包含FLP基因和兩個同向FRT位點，所述BBM基因和FLP基因位于兩個同向FRT位點之間且BBM基因位于FLP基因的下游，所述BBM基因由花椰菜花葉病毒35S啟動子和NOS終止子啟動和終止轉錄，所述FLP基因由熱激啟動子HSP18.2和NOS終止子啟動和終止轉錄。

2.一種構建權利要求1所述的誘導胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達載體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制備

人工合成包含兩個同向FRT位點以及EcoRI、KpnI、SalI、SacI、XhoI和NheI酶切位點的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；

b、中間載體pHSP-FLP-NOS1的構建

b1、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示的引物NOS1-F和核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示的引物NOS1-R為上、下游引物進行PCR擴增，獲得包含終止子NOS且5’端含有XhoI酶切位點、3’端含有SacI酶切位點的DNA片段I；

b2、以載體pTT119為模板，以核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示的引物HSP18.2-F和核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示的引物HSP18.2-R為上、下游引物進行PCR擴增，獲得包含熱激啟動子HSP18.2且5’端含有KpnI和SalI酶切位點、3’端含有XhoI酶切位點的DNA片段II；

b3、以載體pFLP2為模板，以核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示的引物FLP-F和核苷酸序列如SEQ?ID?No.7所示的引物FLP-R為上、下游引物進行PCR擴增，獲得包含FLP基因且5’端和3’端均含有XhoI酶切位點的DNA片段III；

b4、將步驟b1所得DNA片段I用XhoI和SacI雙酶切后，連接到用SalI和SacI雙酶切的載體pBlueScript?SK+上，獲得載體pNOS1；

b5、將步驟b2所得DNA片段II用KpnI和XhoI雙酶切后，連接到用KpnI和XhoI雙酶切的步驟b4所得載體pNOS1上，獲得載體pHSP-NOS1；

b6、將步驟b3所得DNA片段III用XhoI酶切后，連接到用XhoI酶切的步驟b5所得載體pHSP-NOS1上，獲得中間載體pHSP-FLP-NOS1；

c、中間載體p35S-BBM-NOS2的構建

c1、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示的引物NOS2-F和核苷酸序列如SEQID?No.9所示的引物NOS2-R為上、下游引物進行PCR擴增，獲得包含終止子NOS且5’端含有XhoI酶切位點、3’端含有SalI和SacI酶切位點的DNA片段IV；

c2、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ?ID?No.10所示的引物35S-F和核苷酸序列如SEQ?ID?No.11所示的引物35S-R為上、下游引物進行PCR擴增，獲得包含組成型啟動子35S且5’端含有KpnI和SalI酶切位點、3’端含有XhoI酶切位點的DNA片段V；

c3、從油菜中提取總RNA，反轉錄成cDNA，再以所得cDNA為模板，以核苷酸序列如SEQ?ID?No.12所示的引物BBM-F和核苷酸序列如SEQ?ID?No.13所示的引物BBM-R為上、下游引物進行PCR擴增，獲得包含BBM基因且5’端和3’端均含有XhoI酶切位點的DNA片段VI；

c4、將步驟c1所得DNA片段IV用XhoI和SacI雙酶切后，連接到用SalI和SacI雙酶切的載體pBlueScript?SK+上，獲得載體pNOS2；

c5、將步驟c2所得DNA片段V用KpnI和XhoI雙酶切后，連接到用KpnI和XhoI雙酶切的步驟c4所得載體pNOS2上，獲得載體p35S-NOS2；

c6、將步驟c3所得DNA片段VI用XhoI酶切后，連接到用XhoI酶切的步驟c5所得載體p35S-NOS2上，獲得中間載體p35S-BBM-NOS2；

d、植物雙元表達載體pLFFLPBBM的構建

d1、將步驟a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用EcoRI和NheI雙酶切后，連接到用EcoRI和NheI雙酶切去除T-DNA序列的載體pBIN19上，獲得載體pLF；

d2、將步驟c所得中間載體p35S-BBM-NOS2用SacI和SalI雙酶切后，獲得DNA片段35S-BBM-NOS，將其插入到用SacI和SalI雙酶切的步驟d1所得載體pLF上，獲得載體pLFBBM；

d3、將步驟b所得中間載體pHSP-FLP-NOS1用SalI酶切后，獲得DNA片段HSP-FLP-NOS，將其插入到用SalI酶切的步驟d2所得載體pLFBBM上，即獲得植物雙元表達載體pLFFLPBBM。

3.利用權利要求1所述的植物雙元表達載體誘導胚狀體形成和植物再生的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、將植物雙元表達載體pLFFLPBBM轉化根瘤農桿菌，獲得含有植物雙元表達載體pLFFLPBBM的根瘤農桿菌；

b、將步驟a所得含有植物雙元表達載體pLFFLPBBM的根瘤農桿菌浸染雙子葉植物的愈傷組織，在不添加植物激素的條件下誘導植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導胚狀體形成幼苗，獲得轉基因植株；

c、在步驟b所得轉基因植株的幼苗中誘導FLP表達，從轉基因植株的基因組中刪除BBM基因和FLP基因。