[發明專利]誘導胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200810237002.7
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101445809A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發明（設計）人: 鄧偉;李正國;楊迎武;羅克明;金凱
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/31;A01H1/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種重組表達載體，特別涉及一種誘導胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達載體，還涉及該表達載體的構建方法和應用。

背景技術

利用基因工程技術把特定的外源基因導入植物受體中，達到改變植物性狀(如抗蟲、抗病、抗逆等)以及快速培育植物新品種的目的，是現代遺傳育種的重要途徑。

植物基因工程的核心是植物的遺傳轉化。植物遺傳轉化方法主要分為兩類：即利用載體系統轉化(如農桿菌介導法、脂質體法等)和直接遺傳轉化(如基因槍法、PEG法、電激法、顯微注射法、花粉管通道法、超聲波法等)。其中，農桿菌介導法是采用含有目的基因的農桿菌浸染植物受體，通過誘導抗性植物再生從而獲得轉基因植株。由于其具有易操作、低費用、高效率、插入片段確定性好和轉基因拷貝數低等獨特優點，已經成為植物遺傳轉化的首選方法。目前，通過農桿菌介導方法獲得轉基因植株的植物已達100種以上，包括水稻、玉米、馬鈴薯、棉花、大豆、油菜、番茄、黃瓜、苜蓿、核桃、蔬菜和牧草等。但是，該方法仍然存在以下問題：(1)一些重要植物(如木本植物、單子葉植物)的轉化頻率低，轉化植株難于再生；(2)同種植物不同品種之間的轉化頻率和再生頻率差異大；(3)一些在生產上運用較廣的植物品種難以進行遺傳轉化等。研究發現，存在上述問題的主要原因在于：植物再生困難，組織培養中無法獲得再生苗。

發明內容

有鑒于此，為克服現有植物遺傳轉化技術存在的不足，本發明的目的之一在于提供一種誘導胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達載體，不僅可以利用外源基因的超量表達促進植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導形成轉基因植株，顯著提高植物的轉化頻率和再生頻率，而且可以從轉基因植株的基因組中有效地刪除外源基因，以消除外源基因的超量表達對轉基因植株的負面影響。

為達到此目的，本發明的植物雙元表達載體，包含BBM基因和FLP-FRT位點特異性重組系統，所述FLP-FRT位點特異性重組系統包含FLP基因和兩個同向FRT位點，所述BBM基因和FLP基因位于兩個同向FRT位點之間，BBM基因由組成型啟動子控制，FLP基因由誘導型啟動子控制。

進一步，所述組成型啟動子選自花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、甘露堿合成酶基因(mas)啟動子或章魚堿合成酶基因(ocs)啟動子；

進一步，所述誘導型啟動子選自熱激啟動子HSP18.2、Gmhsp17.5-E或Gmhsp17.5C；

進一步，所述植物為雙子葉植物；

進一步，所述雙子葉植物為楊樹；

進一步，所述植物雙元表達載體為pLFFLPBBM。

胚狀體誘導是植物組織培養的常用方法，具有增殖率高、可免去生根步驟等優點。BBM(BABY?BOOM)基因(核苷酸序列如SEQ?ID?No.14所示)來自于油菜(Brassica?napus)，為AP2/ERF家族成員，在發育的胚中特異性表達，可以促進細胞分裂和體細胞胚胎的形態發生變化，起誘導植物激素的作用或提高細胞對激素的敏感性。BBM基因超量表達，可以使外植體在沒有外源激素的條件下產生大量的胚狀體，顯著提高植物的再生頻率。

FLP-FRT位點特異性重組系統來自于啤酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)細胞核內2μm質粒，由FLP基因(核苷酸序列如SEQ?ID?No.15所示)和FLP重組識別位點(FLP?recognition?target，FRT)組成，重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個同向FRT(loxPFRT)位點間DNA片段的切除。由于BBM基因的超量表達會對轉基因植株產生一些負面影響，如植物矮化、形成玫瑰型葉片、花器官異型和降低植物育性等，在BBM基因發揮完誘導胚狀體形成和植物再生的作用后，在轉基因植株中誘導FLP表達，催化位于BBM基因兩側loxPFRT位點間的重組反應，即可從轉基因植株的基因組中有效地刪除BBM基因，消除其對轉基因植株的負面影響。