[發(fā)明專利]以蛋白中色氨酸殘基為Forster共振能量轉(zhuǎn)移供體的均相親和分析方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810237000.8
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101452002A
• 公開（公告）日: 2009-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖飛;鄧萍;謝燕玲;楊曉蘭;趙運勝;朱莎;廖娟;劉冬;于明安
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明利用在小分子熒光標(biāo)記配體(或半抗原)作為分析探針與蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物中，蛋白色氨酸殘基與探針之間發(fā)生Forster共振能量轉(zhuǎn)移(Forster-resonance-energy-transfer，F(xiàn)RET)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的色氨酸熒光被猝滅而下降并伴隨產(chǎn)生探針的特征性熒光發(fā)射而升高，據(jù)此建立不需分離結(jié)合和游離探針的均相熒光親和分析方法；此均相熒光親和分析方法可用于測定混合物中的蛋白含量、配體與蛋白的親和力、高親和力配體的含量等，在實驗診斷、配體類藥物篩選等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。?

發(fā)明的技術(shù)背景

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域選擇性測定混合物中的特定蛋白、蛋白與配體的親和力、特定配體或半抗原的含量是重要的基礎(chǔ)工作；這些測定通常依賴于蛋白同特殊配體、半抗原或抗原的高選擇性結(jié)合生成復(fù)合物，稱為親和分析。目前，親和分析選擇性測定混合物中的特定蛋白主要用單抗作為探針測定蛋白抗原含量，如酶聯(lián)免疫測定、放射免疫測定等；但這兩類技術(shù)都需分離結(jié)合的抗體探針與游離的抗體探針，操作繁瑣而效率低，且使用同位素的危害大。親和分析測定蛋白與配體的親和力可采用放射性同位素標(biāo)記配體結(jié)合法、熒光極化法、Forster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)法等。其中，使用同位素標(biāo)記配體為探針的方法也需分離結(jié)合與游離的探針、操作效率低且危害大，而熒光極化法和FRET法都不需分離結(jié)合與游離的標(biāo)記配體探針，屬于均相親和分析；但熒光極化法靈敏度低，F(xiàn)RET需用特殊熒光基團分別修飾相應(yīng)蛋白和參考配體構(gòu)成對應(yīng)的FRET供體(donor)和接受體(acceptor)，顯然對蛋白進行修飾容易改變蛋白的功能且需要成本。因此，現(xiàn)有均相熒光親和分析方法仍然有不足之處。?

FRET法用于均相親和分析靈敏度通常較高。因此，如果不需用特殊的熒光團標(biāo)記蛋白質(zhì)就能以FRET為基礎(chǔ)進行均相親和分析測定對應(yīng)蛋白含量、配體親和力和配體當(dāng)量，則無疑是一種更理想的均相熒光親和分析方法。?

發(fā)明內(nèi)容概述

本發(fā)明旨在利用天然蛋白質(zhì)中色氨酸殘基為其內(nèi)在FRET供體從而避免對蛋白的修飾需求，同時設(shè)計對此蛋白有高特異性結(jié)合能力且?guī)в刑厥鉄晒鈭F的配體作為相應(yīng)的FRET接受體(此后稱為天然蛋白的FRET探針)，使得在此FRET探針同該蛋白的復(fù)合物中，由于色氨酸殘基與探針中熒光團的距離比在溶液中游離狀態(tài)時顯著縮短，從而可有效發(fā)生FRET，使被選擇性激發(fā)的色氨酸殘基可將能量轉(zhuǎn)移到熒光配體上的熒光團，造成色氨酸殘基的熒光被猝滅而下降，同時探針熒光團發(fā)射特有的熒光信號，建立起對應(yīng)的均相熒光親和分析體系。?

發(fā)生FRET要求供體的熒光發(fā)射光譜與接受體的熒光激發(fā)光譜有效重疊，供體相對于接受體有所需相對取向，供體熒光團相對于接受體熒光團的距離需要足夠近。蛋白分子足夠大時通常含有一定數(shù)量色氨酸殘基，并在280nm附近激發(fā)時產(chǎn)生發(fā)射峰位于340nm附近的特殊熒光，故蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基可作為內(nèi)在的FRET供體。如果FRET探針與蛋白之間沒有特異性相互作用，則探針與任何蛋白分子溶液中均勻分布；FRET探針與蛋白濃度處在微摩爾每升水平時，探針與蛋白任何氨基酸殘基之間的穩(wěn)態(tài)距離都在100nm左右。發(fā)生FRET通常要求相應(yīng)供體與接受體之間的距離在7.0nm以內(nèi)；一般蛋白的形狀為球狀且直徑小于7.0nm，通常蛋白中色氨酸殘基含量可達到2％左右，而且接近均勻分布在整個構(gòu)象空間。因此，以色氨酸殘基為內(nèi)在FRET供體而分析探針為FRET接受體，如蛋白與FRET探針之間沒有相互作用則FRET探針與蛋白色氨酸殘基之間不能發(fā)生有效的FRET；當(dāng)FRET探針與蛋白發(fā)生特異相互作用生成復(fù)合物后，復(fù)合物內(nèi)探針熒光團與蛋白色氨酸殘基之間的距離就可遠(yuǎn)小于7.0nm，從而可發(fā)生有效的FRET。因此，只要獲得滿足要求的熒光標(biāo)記配體作為天然蛋白的FRET探針，就可建立起以天然蛋白中色氨酸殘基為內(nèi)在FRET供體，以探針FRET熒光升高或蛋白色氨酸殘基熒光猝滅為檢測信號且對含有色氨酸殘基蛋白通用的均相熒光親和分析系統(tǒng)，其不需對蛋白進行任何修飾，測定蛋白含量時不需要競爭結(jié)合，具有明顯優(yōu)勢。?