[發明專利]以蛋白中色氨酸殘基為Forster共振能量轉移供體的均相親和分析方法

無效

• 申請號: 200810237000.8
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101452002A
• 公開（公告）日: 2009-06-10
• 發明（設計）人: 廖飛;鄧萍;謝燕玲;楊曉蘭;趙運勝;朱莎;廖娟;劉冬;于明安
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種均相熒光親和分析方法，其特征是用熒光標記的小分子配體或半抗原為探針與蛋白 形成復合物，在復合物中色氨酸殘基與配體探針發生Forster共振能量轉移，引起蛋白 質自身熒光信號下降而熒光標記配體探針的特有熒光信號升高；該方法適用于測定混合 物中蛋白含量、高親和力配體或半抗原含量、配體與該蛋白的親和力，其應用特征如下：

(一)此均相熒光親和分析方法需選擇帶有特殊熒光團且與蛋白高特異性結合的小分子 配體為Forster共振能量轉移探針，要求此探針有如下熒光光譜特征：

(1)在蛋白與探針的復合物中蛋白質色氨酸殘基為Forster共振能量轉移的內在供 體，而對應探針為Forster共振能量轉移的接受體；

(2)在探針與該蛋白的復合物中，色氨酸殘基與探針之間發生Forster共振能量轉移， 使得色氨酸殘基熒光被猝滅而下降，同時該探針的特有熒光信號顯著增強；

(3)這些熒光信號的變化與所生成蛋白與探針復合物的量成正比，從而不需分離結 合與游離探針就可監測探針與對應蛋白之間的相互結合；

(4)所用游離探針在260到300nm之間存在熒光激發谷而在310到370nm之間存 在熒光激發峰；探針與蛋白結合后因Forster共振能量轉移表現出在260到300nm之間 的特殊激發峰和探針特有熒光發射峰；

(5)所用Forster共振能量轉移探針具有如下特征則分析靈敏度更高；這些特征包括 與對應蛋白結合后探針的熒光量子產率高于游離探針的熒光量子產率，與對應蛋白結合 后探針的熒光發射光譜不同于游離探針的熒光發射光譜；

(6)所用Forster共振能量轉移探針是蛋白結合基團與熒光標記基團的加合物；蛋白 結合基團應根據結合部位構象設計，而對應熒光標記基團主要是萘胺和香豆素衍生物， 通過相應取代或縮合反應等方式生成對應探針加合物；此類熒光標記基團包括但不限于 在α-萘胺芳香氮原子上連短鏈烷基并在烷基的另一端連上羥基或氨基或巰基的衍生物；

(二)此均相熒光親和分析方法適用于測定混合物中對應蛋白含量、配體親和力、特定 配體含量；這三種不同類型的應用對探針親和力有不同要求，具體如下：

(1)測定混合物中對應結合蛋白含量的探針，其與該待測蛋白需有高親和力；

(2)測定特定配體含量探針，其親和力需低于所需定量測定配體的親和力；

(3)測定特定配體親和力探針，其親和力需低于待測配體親和力。

2.據權利要求1所述均相熒光親和分析方法，其測定非熒光配體的親和力時，因所用蛋白 與其Forster共振能量轉移探針的濃度相當，故用候選配體競爭結合的半有效濃度計算 其解離常數時需考慮競爭結合過程中探針濃度的下降。

3.據權利要求1所述均相熒光親和分析方法，其測定配體親和力時，應據候選配體的散射 光譜選擇測定探針的Forster共振能量轉移熒光信號增強還是蛋白質色氨酸熒光下降以 避免候選配體散射信號干擾；如候選配體自身有熒光，則要求此候選熒光配體對探針的 Forster共振能量轉移熒光或蛋白色氨酸熒光沒有干擾，否則以此熒光候選配體與已知 親和力非熒光配體競爭結合來確定此候選熒光配體的親和力。