[發明專利]快速同步檢測沙眼衣原體、細小脲原體和解脲脲原體的試劑盒

有效

• 申請號: 200810236989.0
• 申請日: 2008-12-23
• 公開（公告）號: CN101497926A
• 公開（公告）日: 2009-08-05
• 發明（設計）人: 王業富;呂振興;周立;唐景峰;張長明
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 黃瑞棠

1.一種快速同步檢測沙眼衣原體、細小脲原體和解脲脲原體的試劑盒，其 特征在于：

1)DNA核酸提取液；

2)含有三種病原體檢測序列的標準陽性模板，三種病原體分別是沙眼衣原 體、細小脲原體以及解脲脲原體；

3)一步法單管單酶多項聯合檢測的TaqMan?PCR擴增體系由含有PCR 10×buffer，分別為10μmol/L的沙眼衣原體、細小脲原體以及解脲脲原體正、反 向引物，分別為5μmol/L的沙眼衣原體、細小脲原體以及解脲脲原體的熒光探 針，25mmol/L?MgCl₂，10mmol/L?dNTPs?mix和無菌雙蒸水組成，其中引物和標記 探針如下：

①沙眼衣原體

正向引物為5′-TTCAGTTGGGCCAGATCATG-3′，

反向引物為5′-CTCTTCATCGGTGGCTAATGTATAAA-3′；

熒光探針序列為5′-AGGCTCGTCCTGACTCATGCATTTCG-3′；

熒光探針5′端標記FAM，3′端標記非熒光淬滅基團Eclipse，標準陽性模板 pU-CT是含有沙眼衣原體高度保守基因trp基因73個堿基對的核苷酸片段構成的 pUCm-T載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖；

②細小脲原體

正向引物為5′-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3′，

反向引物為5′-TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′；

熒光探針序列為5′-TTGACCACCCTTACGAG-3′；

熒光探針5′端標記報告熒光基團VIC，3′端標記不發光的淬滅基團標記，并連 接小型凹槽結合物-MGB基團，可以大大提高探針的退火溫度，標準陽性模板pU-UP 是含有細小脲原體高度保守基因-脲酶基因的111個堿基對的核苷酸片段構成的 pUCm-T載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖；

③解脲脲原體

正向引物為5′-ATCGACGTTGCCCAAGGGGA-3′

反向引物為5′-TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3′；

熒光探針序列為5′-TTGTCCGCCTTTACGAG-3′；

熒光探針5′端標記報告熒光基團TAMRA，3′端標記不發光的淬滅基團標記，并 連接小型凹槽結合物-MGB基團，標準陽性模板pU-UU是含有解脲脲原體高度保守 mba基因的110個堿基對的核苷酸片段構成的pUCm-T載體，該載體在大腸桿菌 DH5α中增殖。

2.按權利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于標準陽性模板包 括：

CT標準陽性模板pU-CT包含的trp基因的核苷酸序列為

TTCAGTTGGGCCAGATCATGCCGAAATGCATGAGTCAGGACGAGCCTTTTATACATTAGCCACCGATGA AGAG；

UP標準陽性模板pU-UP包含的ureE基因的核苷酸序列為

CATTGATGTTGCACAAGGAGAAAAAATTCCTCGTAAGGGTGGTCAAGGRATGATTAAATCAGAYTTATT TATTATTAATAAAGTTGATTTAGCTCCTTATGTTGGTGCTAA；

R：G或者A；Y：T或者C；

UU標準陽性模板pU-UU包含mba基因的核苷酸序列為

ATCGACGTTGCCCAAGGGGAAAAAATTCCTCGTAAAGGCGGACAAGGAATGATTAAATCAGATTT ATTCATCATCAATAAAGTTGATTTAGCTCCTTATGTTGGTGCTAA；

所述的CT、UP和UU分別表示沙眼衣原體、細小脲原體和解脲脲原體。