[發明專利]一種檢測玉米赤霉烯酮的ELISA測試盒及制備及檢測方法

有效

• 申請號: 200810236336.2
• 申請日: 2008-11-07
• 公開（公告）號: CN101413955A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: 徐祖奇;張建中;毛麗華
• 申請（專利權）人: 無錫益達生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 無錫盛陽專利商標事務所（普通合伙）
• 代理人: 顧吉云

1.一種檢測玉米赤霉烯酮的ELISA測試盒的制備，所述檢測玉米赤霉烯酮 的ELISA測試盒，其包括洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液，其還包 括包被板、玉米赤霉烯酮標準品、玉米赤霉烯酮單抗凍干品和酶標記 的羊抗鼠抗體凍干品，其特征在于：其包括以下步驟，包被板的制備 、玉米赤霉烯酮標準品的制備、玉米赤霉烯酮單抗凍干品的制備、酶 標記的羊抗鼠抗體凍干品的制備；所述包被板包被固相抗原，其可采 用96或48或24孔微孔板，用10?mmol／L?~100mmol／L??pH9~10? ?Na2CO3-NaHCO3的緩沖液作為包被液，將玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(Z EN-OVA)稀釋至0.1μg/m?L?~1.0μg/m?L，96或48或24孔微孔板各 孔加100μl，2℃~8℃放置過夜，棄去包被液，洗滌2次~5次，按加入 含1~5%牛血清白蛋白，pH?7~8的磷酸鹽緩沖液，2℃~8℃封閉過夜， 棄去封閉液，吹干，板條密封后置-40℃~-20℃冷凍保存；所述玉米赤 霉烯酮標準品從玉米赤霉烯酮純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水， ZEN濃度為：0.001?ng/mL~50?ng/mL；玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白 (ZEN-BSA)偶聯物的制備：將ZEN溶解在3mL~100mL吡啶中，加入羧甲基 羥胺鹽酸鹽，室溫下攪拌過夜，氮氣吹干，加入10ml~100ml蒸餾水， 用氫氧化鈉溶液調pH為8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提取3次~5次，每 次10ml~20ml，棄去二氯甲烷，水層用鹽酸溶液調pH為2.5~3.5左右， 再用二氯甲烷提取3次~6次，每次10ml~20ml，收集二氯甲烷，過無水 硫酸鈉脫水，過濾，低溫用氮氣吹干，得到ZEN中間產物；取ZEN中間 產物，加入3ml~50ml二氧六環，加入氯甲酸異丁酯，5℃~12℃下攪拌 反應30分鐘～45分鐘，將反應液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清 白蛋白溶于5ml~50ml蒸餾水和5ml~50ml二氧六環中，用氫氧化鈉溶液 調pH為8～9，5℃~12℃下攪拌反應5小時～6小時，然后，以蒸餾水進 行透析，換液3次~5次，冷凍干燥，偶聯物-40℃~-20℃保存；上述反 應成分的比例為：ZEN：羧甲基羥胺鹽酸鹽?=?(10~1000)mg?：(10 ~2000)mg?，ZEN中間產物：氯甲酸異丁酯：BSA?=?(10~1000)mg? ：(10~1000)μl?：(10-3000)mg；玉米赤霉烯酮-卵清蛋白(ZEN-OVA )偶聯物的制備：將ZEN溶解在3mL~100mL吡啶中，加入羧甲基羥胺鹽酸 鹽，室溫下攪拌過夜，氮氣吹干，加入10ml~100ml蒸餾水，用氫氧化 鈉溶液調pH為8.5~9.5左右，再用二氯甲烷提取3次~5次，每次10ml~2 0ml，棄去二氯甲烷，水層用鹽酸溶液調pH為2.5~3.5左右，再用二氯 甲烷提取3次~6次，每次10ml~20ml，收集二氯甲烷，過無水硫酸鈉脫 水，過濾，低溫用氮氣吹干，得到ZEN中間產物；取ZEN中間產物，加 入3ml~50ml二氧六環，加入氯甲酸異丁酯，5℃~12℃?下攪拌反應30 分鐘～45分鐘，將反應液滴加到卵清蛋白中，然后卵清蛋白溶于5ml~ 50ml蒸餾水和5ml~50ml二氧六環中，用氫氧化鈉溶液調pH為8～9，5℃ ~12℃?下攪拌反應5小時～6小時，然后以蒸餾水進行透析，換液3次 ~5次，冷凍干燥，偶聯物-40℃~-20℃保存；上述反應成分的比例為： ZEN：羧甲基羥胺鹽酸鹽?=?(10~1000)mg?：(10~2000)mg?，ZEN中 間產物：氯甲酸異丁酯：OVA?=?(10~1000)mg?：(10~1000)μl?： (10-3000)mg；所述酶標記的羊抗鼠抗體凍干品為辣根過氧化物酶-羊 抗鼠抗體凍干品；所述洗滌液為含有吐溫和NaN3的磷酸鹽緩沖溶液； 所述顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述顯 色液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。

2.根據權利要求1所述一種檢測玉米赤霉烯酮的ELISA測試盒的制備：其 特征在于，所述抗玉米赤霉烯酮（ZEN）單克隆抗體及其溶液的制備： 取ZEN-BSA偶聯物用生理鹽水配成0.1μg/μl~10?μg/μl抗原溶液， 與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強免疫時 用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫采用小鼠腹腔 內直接注射，免疫劑量為10μg/只~100?μg/只小鼠，以后每隔2周~ 4周加強免疫一次，加強免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10μg/只~10 0?μg/只，最后一次免疫采用脾內注射，4天后取脾融合，將分離的 免疫小鼠脾細胞與處于對數生長期的骨髓瘤細胞SP-2/o以10:1比例混 合，離心，去除上清，在50?S～90?S內將0.1~10?ml?50％分子量 為1500的聚乙二醇加至細胞中，充分混勻，使其融合，1分鐘~3分鐘后 加入10?ml?~50?ml?DMEM培養液，終止融合，水浴靜止10分鐘~30 分鐘后離心，去除上清；將融合細胞用含5％~30％小牛血清的HAT選擇 性培養基懸浮后，以最后濃度為1×104~1×106飼養細胞/0.1?ml接種 于以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96孔培養板中，于5％~10%CO2，35 ℃~45℃條件下培養，5天~10天后，每培養孔更換2/3?HT培養液，10 天～20天后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔，取上清液進行 篩選，對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆，雜交瘤 篩選采用固相抗原間接非競爭ELISA法進行，以玉米赤霉烯酮-卵清蛋 白(ZEN-OVA)為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以SP-2/o骨 髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照；陽性細胞孔的判定標準為（A試驗 -?A空白?）/(A對照-A空白)>2.1；對分泌陽性抗體的細胞進行克隆 ；采用有限稀釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一微滴至培養瓶內，倒 置顯微鏡下準確計數細胞個數，稀釋為70個／m1，再取1?ml稀釋20倍 ，接種入96孔培養板中進行亞克隆，直至所有細胞孔的培養上清均呈 陽性為止；對10周齡～13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3?ml/ 只～0.5?ml/只，8天～10?天后，腹腔注射培養至對數期的雜交瘤細 胞，5×105細胞/只，5?天后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀， 加甘油于-40℃~-20℃保存；上述反應成分的比例為：ZEN-BSA?：生 理鹽水?=?(10~1000)?μg?：(0.1~10)m1。