[發明專利]一種宿主細胞及其用于重組蛋白高效分泌表達的方法

有效

• 申請號: 200810235368.0
• 申請日: 2008-12-08
• 公開（公告）號: CN101418276A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 王正祥;牛丹丹;石貴陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N15/55;C12N15/75;C12N9/26;C12N9/42;C12N9/16;C12R1/10
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明為一種用于重組蛋白高效分泌表達的芽孢桿菌宿主細胞。本發明中的宿主細胞為通過微生物菌種選育獲得的芽孢桿菌。本發明的宿主細胞可以滿足重組蛋白的高效合成并將合成的重組蛋白分泌到培養基中。本發明的宿主細胞高效制備的重組蛋白為具有工業應用價值的酶，進一步為具有淀粉水解活性的α-淀粉酶、植酸酶等大宗酶制劑。本發明屬微生物學和發酵工程領域。

背景技術

從自然界獲得的重要蛋白質，如酶、生物活性多肽、藥用蛋白等，由于在自然條件下含量低，往往達不到商業開發價值，需要對其進行高效、低成本制備。實現這些重要蛋白質的高效、低成本制備的主要方法之一是，通過基因克隆技術，將這些重要蛋白質的編碼基因在合適的表達宿主細胞中進行高效表達。由此獲得的基因表達產物，即為重組蛋白。

基因表達宿主細胞(簡稱宿主細胞)是指，從自然界獲得的或通過實驗室操作獲得的、能夠滿足特定基因的轉錄與翻譯、并能將基因產物以一定形式和一定水平生產出、并保證所表達出的基因產物具有原蛋白質相似生物學活性與性能的生物體。

用于重組蛋白表達與制備的生物體可以是動物、植物或微生物。由于微生物細胞具有生長速度快、營養要求簡單、易于遺傳操作以及最重要的一點是能夠進行大規模的人工培養，因此，微生物細胞是目前為止最主要的宿主細胞。

重組蛋白的分泌表達是指，重組蛋白的表達體系(表達載體與表達宿主細胞)能夠引導所表達的重組蛋白實現跨膜運輸，重組蛋白被運送到細胞膜外并被釋放到培養環境(培養基)中。這就要求：1)宿主細胞具有完善的蛋白分泌與蛋白釋放的能力與物質基礎；2)所表達重組蛋白具有被宿主細胞蛋白分泌系統所識別與加工的標識。前者毫無疑問由所采用的宿主細胞決定；后者則由重組蛋白表達單元與宿主細胞共同決定。可見，實現重組蛋白分泌表達的決定性因素是宿主細胞。目前，應用于重組蛋白表達的常用基因表達宿主細胞大腸桿菌，僅有較弱的將重組蛋白分泌到其周質空間的能力，不能將其分泌到培養基中。因此，必須通過細胞裂解過程釋放重組蛋白。另外一種已實現多種工業應用的宿主細胞為畢赤氏酵母，可以利用能夠被其自身蛋白分泌識別系統所識別的、來源于釀酒酵母的α因子信號肽，引導重組蛋白的分泌。這是目前已報導的較好的重組蛋白分泌表達系統，但對大多數來源于細菌的蛋白的表達能力明顯有限。

作為重組蛋白表達的微生物宿主細胞可以是直接通過自然篩選，從自然界中獲得，也可以通過實驗室技術改良現有微生物保藏物的若干生理、生化與遺傳性能獲得。大腸桿菌及其衍生菌株(如大腸桿菌JM109)、酵母及其衍生菌株(如畢赤氏酵母GS115)等都是目前常用的宿主細胞。大腸桿菌宿主細胞表達重組蛋白的水平，可以達到菌體蛋白總量的30％以上(Terpe.Appl?MicrobiolBiotechnol，2006)；缺點是重組蛋白以不溶狀態(包涵體)存在于細胞內，需要復雜的下游提取、純化與復性等過程，才能制備出合格的重組蛋白。因此，大腸桿菌宿主細胞一般僅適用于實驗室研究目的和高附加值藥用蛋白的生產目的，不適用面廣量大的工業酶制劑的生產。酵母宿主細胞表達重組蛋白的最高水平可以達到10mg/mL發酵液(Cregg?JM，et?al.Molecular?Biotechnology，2000)，最大優點是能夠在較高表達水平下，進行重組蛋白的分泌表達。不足之處是，與其它所有宿主細胞一樣，酵母宿主細胞不能滿足絕大多數重組蛋白的高效、分泌表達；另一個缺點是培養時間較長、生產過程中需要有害物質如甲醇的不斷誘導。因此，其它類型的微生物宿主細胞的研究仍然是具有重要價值，并且在某種程度上是必需的。

除了上述描述的大腸桿菌和酵母宿主細胞，微生物宿主細胞的研究還包含有：枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單胞菌、黑曲霉、米曲霉等。

具有工業應用屬性的宿主細胞，特別是運用于滿足高效率、低成本、規模化生產要素的大宗工業酶制劑生產的宿主細胞，一般應具有如下基本特征：1)生物安全性菌株(即所為：General?Regard?As?Safe，GRAS)；2)營養要求簡單，培養條件不復雜；3)具有較強蛋白合成與分泌能力；4)可以進行遺傳操作并且遺傳穩定；5)可以進行大規模工業化培養與操作；6)產物分離容易；等。