[發明專利]一種宿主細胞及其用于重組蛋白高效分泌表達的方法

有效

• 申請號: 200810235368.0
• 申請日: 2008-12-08
• 公開（公告）號: CN101418276A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 王正祥;牛丹丹;石貴陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N15/55;C12N15/75;C12N9/26;C12N9/42;C12N9/16;C12R1/10
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種宿主細胞，其分類命名為地衣芽孢桿菌Bacillus?licheniformis?r^-m^-，CBB3008，巳保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M208236。

2.權利要求1所述的宿主細胞，其特征在于其是一種高效、分泌合成工業酶制劑的地衣芽孢桿菌宿主細胞，革蘭氏陽性桿菌，不形成芽孢，不形成色素；能夠利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纖維素在20～50℃、pH5.5～7.8下生長；無內生質粒；其DNA限制性修飾系統編碼基因簇被刪除，遺傳轉化方便實現；引導工業酶制劑的高效分泌表達，表達水平達到15～30mg/mL。

3.權利要求1所述的宿主細胞，其特征在于最適生長溫度42～45℃，最適生長pH6.8～7.2。

4.用權利要求1所述的宿主細胞進行重組蛋白高效分泌表達的方法，其特征在于通過基因克隆技術獲得工業酶制劑的表達質粒，并在所述宿主細胞中實現高效分泌表達；在所述宿主細胞中高效合成工業酶制劑，再通過所處宿主細胞的蛋白分泌系統，將合成的酶蛋白高效分泌到培養基中；

(1)基因克隆與表達質粒的構建

表達質粒的構建所用表達載體pHY-WZX或pBL-WZX；表達測試用基因為：高溫α-淀粉酶編碼基因amyL，甘露聚糖酶編碼基因manA，或植酸酶編碼基因NcphyN；

上述基因經限制性酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離純化，克隆入表達載體pHY-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位點，獲得相應的表達質粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN；

(2)宿主細胞中實現高效分泌表達：

地衣芽孢桿菌電穿孔轉化與重組菌的篩選，接種地衣芽孢桿菌CCTCC?NO：M208236于2.5mL?LB培養基中，過夜培養后，轉接入50mL生長培養基，即含0.65mol/L山梨醇的LB培養基中，于37℃培養至OD₆₀₀為0.75-0.85，將菌體在冰水浴中放置10min，于4℃、10000r/min離心10分鐘收集菌體細胞，用預冷的含0.65mol/L山梨醇、0.70mol/L甘露醇和10％甘油的EP緩沖液反復洗滌菌體細胞4次，將菌體細胞懸浮于1mL的預冷EP緩沖液中，取100μL菌體細胞懸浮液分裝于1.5mL?Eppendorf管中，取50ng/μL表達質粒pHY-amyL，pHY-manA或pHY-phyN的DNA?1μL，與菌體細胞混勻，移入預冷的電轉化池，1600v電擊5ms后，加入含0.65mol/L山梨醇和0.45mol/L甘露醇的LB培養基的復蘇培養基1mL，37℃、160r/min培養3h，然后涂布含0.025mg/mL卡那霉素或0.05mg/mL四環素的LB平板，于37℃培養2～3天；轉化子通過測定酶活進行確認；

(3)合成的酶蛋白高效分泌：

發酵試驗在250mL三角瓶中裝30mL發酵培養基：酵母膏0.5％～1.5％，蛋白胨1.2％～3.6％，葡萄糖8％～20％；pH7.0；接種步驟(2)獲得的轉化子重組菌，42℃、220r/min下培養5～7天；發酵試驗進一步在15L全自動發酵罐中進行，工作發酵體積10L，過程中維持溶氧為20％以上，并用硫酸或氨水控制pH7.0，定時取樣分析，測定酶活。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于工業酶制劑，選用淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、或植酸酶。?