[發明專利]沙雷氏菌WJ39菌株,由其獲得的低溫蛋白酶及其純化方法

無效

• 申請號: 200810233627.6
• 申請日: 2008-11-24
• 公開（公告）號: CN101412981A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: 魏云林;陸小波;季秀玲;井申榮;林連兵
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C12R1/425
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 賽曉剛

技術領域：

本發明屬于微生物技術領域，具體地，涉及沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株，以及從中獲得的低溫蛋白酶及其純化方法。

背景技術：

地球表面大部分地區屬于低溫環境，其中90％屬于低于5℃的海洋環境，其余為包括永久凍結帶、冰川、極地冰山以及雪山等環境，這些環境中都存在著大量的低溫微生物，它們是低溫酶的主要來源。

蛋白酶是目前應用最多的一種酶，已廣泛應用于農業、環境、食品、洗滌、皮革、飼料等領域。但目前應用的主要為中溫蛋白酶，其最適酶活溫度一般在50℃左右，而低溫蛋白酶由于具有產酶最適溫度低、對熱敏感、低溫下高效催化等特點，使其在食品、化妝、廢物處理、飼料等領域具有廣泛的應用前景。低溫蛋白酶代替洗衣粉中的中溫蛋白酶，可以提高效率，節省用量，因此低溫蛋白酶在洗滌工業中有著很好的應用前景。而且在國外如日本、美國等國家，低溫蛋白酶己因應用于洗滌、食品等行業。

因此對低溫蛋白酶進行純化，并對其生物學特性進行分析，將為今后低溫蛋白酶冷適應性機制研究及其在工農業上的應用研究提供一定的理論依據。

發明內容：

本發明旨在提供一種能在低溫下產生具有較高酶活性的低溫蛋白酶菌株。

本發明的另一目的在于提供一種從沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株中獲得的低溫蛋白酶及其純化方法。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株，菌種保藏號為CGMCC?No.2638。

低溫蛋白酶，從沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株產生，其酶學性質為：最適反應溫度為37℃，并在0-25℃保持穩定；最適pH為8.0-9.0，在pH6.0-10.0保持穩定；蛋白酶的分子量為47.6KDa。

低溫蛋白酶，以沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株為原料由下述方法制備而得：

(1)制備粗酶液：沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株的發酵培養條件為溫度10-25℃，pH7.0-9.0，培養時間15-48小時，將發酵液離心，取上清即為粗酶液；

(2)硫酸銨沉淀：粗酶液加硫酸銨至30-40％飽和度，離心取上清，繼續加硫酸銨至60-70％飽和度，離心棄上清，沉淀在50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0中透析過夜；

(3)DEAE?Sepharose^TMFF陰離子交換層析：將透析的酶液離心，上清進行濃縮，上樣于磷酸鹽緩沖液預平衡過的DEAE?Sepharose^TMFF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純酶。

低溫蛋白酶的純化方法，以沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株為原料，其步驟包括：

(1)制備粗酶液：沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株的發酵培養條件為溫度10-25℃，pH7.0-9.0，培養時間15-48小時，將發酵液離心，取上清即為粗酶液；

(2)硫酸銨沉淀：粗酶液加硫酸銨至30-40％飽和度，離心取上清，繼續加硫酸銨至60-70％飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；

(3)DEAE?Sepharose^TMFF陰離子交換層析：將透析的酶液離心，上清進行濃縮，上樣于磷酸鹽緩沖液預平衡過的DEAE?Sepharose^TMFF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純酶。

步驟(1)中發酵條件的優化；步驟(2)中分離純化所用的緩沖液為50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0；進一步將步驟(3)得到的純酶樣品進行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12.5％，濃縮膠濃度為5％。

沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株，分離自冷凍肉聯廠。菌株篩選培養基為(g/L)：酵母提取物，1；NaCl，10；干酪素，20；瓊脂，20；pH7.0-7.2。沙雷氏菌(Serratia?sp.)WJ39菌株，菌落為圓形，濕潤，淺黃色，粘稠；細胞為短桿狀，革蘭氏陰性菌，生長pH范圍是5.0-9.0，最適pH為7.2；溫度范圍是4-37℃，最適生長溫度為13℃。

經形態學和生理生化特征鑒定，結合16S?rRNA基因序列分析，將分離的低溫細菌鑒定為沙雷氏菌屬的一個菌株，命名為Serratia?sp.WJ39。