[發明專利]一種篩選畢赤酵母高拷貝數轉化子的方法

無效

• 申請號: 200810230877.4
• 申請日: 2008-11-14
• 公開（公告）號: CN101649347A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 張建云;崔樹軍;谷立坤;廉有軒;金維平
• 申請（專利權）人: 河南工程學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及畢赤酵母基因工程菌的篩選方法，具體內容是關于畢赤酵母高拷貝數轉化子的快速篩選方法，屬于基因工程領域。

技術背景：

分子生物學技術的發展為利用生物反應器生產外源蛋白提供了許多方法和手段。到目前為止，已發展出了大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等多種蛋白表達系統，畢赤酵母(Pichia.pastoris)基因表達系統經過近十年發展，已基本成為較完善的外源基因表達系統，具有易于高密度發酵，表達基因穩定整合在宿主基因組中，能使產物有效分泌并適當糖基化，培養方便經濟等特點。利用強效可調控啟動子AOX1，已高效表達了HBsAg、TNF、EGF、破傷風毒素C片段、基因工程抗體等400多種外源蛋白，證實該系統為高效、實用、簡便，以提高表達量并保持產物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統，而且非常適宜于擴大為工業規模。

利用畢赤酵母表達外源基因一般包括以下步驟：①將外源基因插入畢赤酵母表達載體；②用內切酶處理線性化的重組質粒轉化畢赤酵母菌株；③將轉化物接種HIS4營養缺陷平板進行陽性重組子的首輪篩選；④用G418梯度平板進行陽性重組子的第2輪篩選；⑤進一步確定外源基因在酵母基因組中的整合情況；⑥小規模誘導培養鑒定外源基因的表達；⑦大規模誘導培養制備重組蛋白。為了提高外源基因在畢赤酵母中的表達量，通常需要篩選含高拷貝數外源基因的畢赤酵母轉化子，而高拷貝數轉化子的篩選是通過利用提高G418抗性來完成的。(在畢赤酵母常用的系列表達載體PIC9K，PIC3.5K，PIC9中，引入了G418抗性標記基因。轉化完成后，外源基因和抗性基因以同源重組的方式同時整合到畢赤酵母染色體上。通過提高G418的抗性，可以篩選到多拷貝數插入的外源基因)

為了篩選到高拷貝數的陽性克隆子，需要用不同濃度梯度的G418平板進行篩選，常用的G418濃度梯度有0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0mg/ml.invitrogen公司的protocol上介紹了兩種篩選方案。第一種方法是制備不同濃度梯度的G418平板，用影印的方法將HIS4營養缺陷平板上的陽性克性克隆子逐一影印到G418梯度平板上進行高拷貝數克隆子的篩選。這種方法的特點是工作量大(在影印之前還需連續轉接培養3次，以保證影印時每個單克隆子的濃度相當)，篩選難度高，周期長，而且篩選的克隆子數相對較少；第二種方法同樣需要制備不同濃度梯度的G418平板，不同的是可以用無菌水或培養基將HIS4營養缺陷平板上的全部陽性克隆子洗下來，稀釋到合適的濃度，取一定量分別涂到G418濃度梯度平板上，這樣的操作相對簡單，能篩選的克隆子較多，但需要預先做菌體稀釋。這兩種篩選方案是目前國內外科技工作者利用畢赤酵母表達系統表達外源蛋白時使用的通用篩選方法。從上述介紹可以看出，這兩種篩選方案各有利弊，但是它們共同的缺點就是需要配制10種不同濃度梯度的G418篩選平板，G418的用量大，操作繁瑣，工作量大，費時費力。

發明內容：

針對以上兩種篩選方案共同存在的弊端，本發明提供了一種操作簡單，結果可靠，節約成本的快速篩選畢赤酵母高拷貝數轉化子的方法。

本發明的核心內容：用自制的G418篩選平板進行畢赤酵母高拷貝數轉化子的篩選，可以達到用1個平板代替10個不同濃度梯度G418平板進行篩選的目的。其優點如下：

1)簡化工作程序，縮小工作量。利用1個平板進行篩選就可以達到用10個平板進行篩選的效果，提高工作效率。

2)節約成本，提高篩選工作的性價比。畢赤酵母高拷貝數基因工程菌篩選過程中用到的G418價格在400元/克。使用新型篩選平板可以使G418的用量節約80％以上，極大的降低了技術成本。

3)本篩選平板所涵蓋的濃度梯度范圍更廣。畢赤酵母轉化子拷貝數越高，抗G418的能力越強。但是高抗性的轉化子數目較少，為了能夠盡量多的篩選到較高抗性的轉化子，protocol要求做10個不同濃度梯度的G418抗性平板，但不同濃度之間的空白區可能會造成篩選過程中的遺漏。(比如3.5mg/ml的抗性的轉化子就可能會在篩選過程中被漏掉。)而本發明中特制的平板能夠形成連續的濃度梯度，不會造成篩選過程中高抗性轉化子被遺漏的現象。

G418斜面濃度梯度平板的制作流程及原理如下(以最高濃度為4.0mg/mlG418的斜面濃度梯度平板為例)：