[發(fā)明專利]林蛙抗癌肽及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810230190.0
• 申請(qǐng)日: 2008-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN101445554A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尚德靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C07K1/16;C07K1/14;A61K38/17;A61P35/00;A23L1/29
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于抗癌藥物及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗癌活性的林蛙抗 癌肽藥物及其制備方法。

背景技術(shù)

林蛙(Rana?chensinensis)是我國東北地區(qū)長白山麓藥、食兩用的珍貴蛙種。 林蛙是兩棲類動(dòng)物，生存環(huán)境復(fù)雜多樣，它們的皮膚在維持它們生存和適應(yīng)廣 闊棲息地中起著重要作用，為了適應(yīng)存環(huán)境，蛙類的皮膚中分布了種類繁多、 具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，是一個(gè)巨大的生物活性分子資 源庫和藥物資源庫。

目前，國內(nèi)對(duì)林蛙干皮抗菌肽進(jìn)行了研究，申報(bào)的專利也在增多，其中 CN1216768A“生物抗菌肽及其制備方法”是涉及一種具有廣譜抗菌活性的林蛙 蛙皮生物抗菌肽及其制備方法；CN1583166A“林蛙抗菌肽噴霧劑及其制備方 法”、CN1583165A“林蛙抗菌肽凝膠劑及其制備方法”是涉及保護(hù)林蛙皮膚 抗菌肽以噴霧劑和凝膠劑兩種形式用于臨床皮膚感染、燒傷燙傷感染領(lǐng)域； CN1679632A“林蛙鎮(zhèn)痛水提物及其制備方法及”是關(guān)于保護(hù)從林蛙干皮中提取 的一種具有鎮(zhèn)痛作用的林蛙鎮(zhèn)痛水提物及其制備技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有抗癌藥物的不足，提供一種林蛙抗癌肽及其制備方 法，該抗癌肽具有用量少，對(duì)多種癌細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷力，不損傷正常細(xì)胞等優(yōu) 點(diǎn)。

本發(fā)明的林蛙抗癌肽具有如下特征：

以林蛙皮膚為原料于pH3-5酸化乙醇中浸提，將提取液離心后得上清液， 上清液凍干濃縮，溶于蒸餾水中配制成溶液，經(jīng)凝膠柱層析，1-3M醋酸為洗脫 液，280nm檢測(cè)波長下，分離得到分子量為1-10kD具有抗癌活性的肽，凍干濃 縮為白色粉末，其在pH?3-10范圍內(nèi)具有活性，pH值為5時(shí)活性最強(qiáng)，于0～ 10℃保存24個(gè)月仍有活性。

本發(fā)明涉及的林蛙抗癌肽以林蛙皮為原料，其制備方法如下：

1、將林蛙皮加入2-10倍體積的酸化乙醇，于4-20℃浸提24-72小時(shí)。其中 酸化乙醇為0.5-5M鹽酸與乙醇調(diào)至pH值4-5或0.5-5M醋酸與乙醇調(diào)至pH值 3-4為宜；

2、上述提取液在3000-8000rpm下離心10-60min，收集上清液；

3、沉淀重復(fù)2-3次步驟1和2；

4、合并上清液凍干濃縮；

5、凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液；

6、上述溶液經(jīng)Sephadex?G-50凝膠柱層析，4-10℃條件下層析分離。凝膠 柱以1-3M醋酸平衡，上樣，1-3M醋酸洗脫，流速為0.1-0.6ml/min，收集洗脫 液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分， 收集分子量為1-10kD的活性組分，見圖1；

凝膠柱還可以為Sephadex?G-25或Sephadex?G-75。

7、活性組分透析脫鹽，冷凍干燥；于-20℃保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。

本發(fā)明林蛙抗癌肽，體內(nèi)和體外的抗癌作用研究表明林蛙抗癌肽對(duì)S₁₈₀胃 肉瘤、白血病K562細(xì)胞、乳腺癌MCF·7細(xì)胞、卵巢癌SKOV3細(xì)胞、宮頸癌 Hela細(xì)胞、肝癌HepG₂細(xì)胞和肝癌7721細(xì)胞均有明顯的抑制生長作用；并能誘 導(dǎo)K562腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞膜破損、細(xì)胞變形或出現(xiàn)胞芽和縊痕，細(xì)胞皺 縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質(zhì)濃集、邊聚化，胞質(zhì)空泡化等。

本發(fā)明所述的林蛙抗癌肽，其主要用于制備抗癌藥物或保健食品。

附圖說明

圖1林蛙抗癌肽Sephadex?G-50柱層析圖

圖2對(duì)照組K562細(xì)胞；圖3絲裂霉素作用的K562細(xì)胞

圖4林蛙抗癌肽作用的K562細(xì)胞

圖5林蛙抗癌肽作用K562細(xì)胞24h、48h、72h后DNA電泳

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的制備方法，并不是用來限制發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1、將100g林蛙皮加入1000mL酸化乙醇(乙醇與0.5M鹽酸配至pH值為4) 于4℃浸提24小時(shí)；

2、提取液在3000rpm離心80min，收集上清液，沉淀；

3、沉淀再加入1000mL酸化乙醇，于4℃浸提24小時(shí)；

4、提取液在3000rpm離心10min，收集上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?