[發(fā)明專利]重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法及由其制得的重組海參溶菌酶

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810229784.X
• 申請日: 2008-12-15
• 公開（公告）號: CN101423840A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 叢麗娜;朱蓓薇;王秀霞;谷躍峰;楊冠科;郝明;董秀萍
• 申請（專利權(quán)）人: 大連工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N9/36;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 畢 進(jìn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)生產(chǎn)重組海參溶菌酶的方法，屬于分子生物學(xué)制 藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及利用該方法生產(chǎn)出來的重組海參溶菌酶。

背景技術(shù)

溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中粘多糖N-乙 酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，內(nèi)容 物逸出而使細(xì)菌死亡。它廣泛存在于自然界動植物和微生物的組織、體液及分 泌物中，在生物機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。對于缺少特異性免疫的 無脊椎動物而言，抗菌效應(yīng)尤為重要，而無脊椎動物組織中分布最廣泛的抗菌 蛋白即是溶菌酶。不僅如此，溶菌酶還作為無脊椎動物的一種重要的消化酶， 通過分解微生物來獲得生長所需的部分C、N源。

溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強(qiáng)劑和防腐劑目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食 品及飼料等行業(yè)。近年來隨著海洋生物魚類、蝦類、貝類以及海珍品，如海參、 鮑魚等養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長，隨之而來的是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中的品質(zhì)退化、養(yǎng)殖 水平低、疾病泛濫及環(huán)境污染等問題。目前在水產(chǎn)品養(yǎng)殖以及畜禽生產(chǎn)中使用 抗生素帶來的問題也越來越受到人們的關(guān)注，一是耐藥性問題，二是藥物殘留 問題，其副作用是不可忽視的，人們不希望以犧牲人類健康為代價換取海產(chǎn)品、 畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)性能的提高。因此，采用該基因工程菌生產(chǎn)的溶菌酶是一種天然 無毒的酶制品，它對大部分水生動物和畜禽動物即是體內(nèi)自身的免疫因子，又 可作為養(yǎng)殖生產(chǎn)中的抑菌劑，降解和殺死常見的致病菌。所以，該溶菌酶可以 代替抗生素應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中，可以取得安全、品質(zhì)好、功效高的海產(chǎn)品和畜 禽產(chǎn)品。

目前溶菌酶主要從蛋清中提取，由于來源有限，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，溶菌酶產(chǎn) 量十分有限，價格居高不下，難以滿足越來越大的市場需求。因此用基因工程 手段表達(dá)溶菌酶成為很重要的手段。前期的研究者利用RT-PCR和RACE?PCR 技術(shù)，從海參(Stichopusjaponicus)體壁中克隆得到一種溶菌酶基因(GenBank： EF036468)；并通過生物信息軟件分析得到關(guān)于其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)信息(“海 參i型溶菌酶基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)”，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報， 2007年7月，23(7)：542～547)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，提供一種利用生物技術(shù)生產(chǎn)重組海參溶 菌酶的方法。

本發(fā)明提供一種重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，是將海參溶菌酶基因(SEQ?ID NO.1)連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將所形成的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168中，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，然后經(jīng)陽離子交換樹脂層析柱 純化后得到重組溶菌酶。

上述方法中所述的海參溶菌酶基因(SEQ?ID?NO.1)是通過從海參腸組織中 提取RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄獲得。具體做法是：

①從本地新鮮海參中取出海參腸組織，提取總RAN，并通過反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增海 參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域，反轉(zhuǎn)錄所使用的簡并引物為：

HS?1-15′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′

HS?1-25′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′

②擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA片段5′末端，所使用的反轉(zhuǎn)錄引物 RT-Primer(帶磷酸標(biāo)記)和兩對巢式PCR引物序列如下：

RT-Primer?5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′

HS1-S1????5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′

HS1-S2????5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′

HS1-A1????5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′

HS1-A2????5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′

③擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA?3′末端，所使用的引物序列如下：

HS1-GSP1????5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′

HS1-GSP2????5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′