[發明專利]重組海參溶菌酶的生產方法及由其制得的重組海參溶菌酶

有效

• 申請號: 200810229784.X
• 申請日: 2008-12-15
• 公開（公告）號: CN101423840A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發明（設計）人: 叢麗娜;朱蓓薇;王秀霞;谷躍峰;楊冠科;郝明;董秀萍
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N9/36;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司
• 代理人: 畢 進

1.一種重組海參溶菌酶的生產方法，其特征在于該方法是將如SEQ?ID?NO.1 所示的海參溶菌酶基因連接到真核表達載體pPIC9K中構建重組質粒，并將所形 成的重組質粒轉化到畢赤酵母SMD1168中，經甲醇誘導表達，然后經陽離子交 換樹脂層析柱純化后得到重組溶菌酶，具體包括如下步驟：

①獲取海參溶菌酶基因，包括從海參腸組織中提取總RNA，并通過反轉錄 擴增海參溶菌酶的cDNA保守區域、擴增海參溶菌酶基因cDNA片段5′末端及 3′末端的步驟，其中：

擴增海參溶菌酶的cDNA保守區域的反轉錄過程所使用的簡并引物為：

HS1-1???????5′-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3′

HS1-2???????5′-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3′

擴增海參溶菌酶基因cDNA片段5′末端，所使用的帶磷酸標記的反轉錄引 物RT-Primer和兩對巢式PCR引物序列如下：

RT-Primer???5′--(P)TACGGGCAAAATCC--3′

HS1-S1??????5′--ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3′

HS1-S2??????5′--GCAACCTATGCCCGTCTA--3′

HS1-A1??????5′--CCATCCAGACTACCTCCCTT--3′

HS1-A2??????5′--GCATCCTGCCAGTAGCCT--3′

擴增海參溶菌酶基因cDNA?3′末端，所使用的引物為：

HS1-GSP?1′?5′--GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG--3′

HS1-GSP2????5′--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG--3′

②重組質粒的構建：通過PCR、酶切將步驟①獲得的如SEQ?ID?NO.1所示 的溶菌酶基因連接到真核表達載體pPIC9K中，其中PCR使用特異性引物HS1-7 和HS1-8，引物兩端分別引入EcoR?I和Not?I限制性酶切位點：

HS?1-7?????5’----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3’

HS?1-8?????5’----AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT----3’

PCR循環參數為：50℃?30min，94℃?2min；94℃?30s，40℃?30s，72℃ 1.5min，5個循環；94℃?30s，55℃?30s，72℃?1.5min，30個循環；最后72 ℃延伸10min；

回收PCR擴增產物，用EcoR?I和Not?I酶切，然后與經同樣酶酶切的酵母 表達載體pPIC9K相連接形成重組質粒；

③重組質粒的轉化及重組菌株的篩選：將重組質粒DNA用Bgl?II酶解， 用電擊法將質粒DNA轉化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固體培養板上， 30℃培養2～3天；將長出的菌落轉至含有4mg/ml?G418的YPD固體培養基上 進行進一步篩選，將選出的高拷貝轉化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固 體培養基中，30℃培養6～7天，觀察不同菌株對溶壁微球菌的抑菌活性，篩選 高活性的重組菌株；

④重組菌株的甲醇誘導表達及重組溶菌酶的純化：將步驟③篩選得到的重 組畢赤酵母SMD1168先在BMGY液體培養基中，30℃搖瓶培養，250轉/分鐘； 當OD值達到9.0±0.5時，更換培養基，用原培養物10％體積的BMMY培養基， 繼續培養；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0.5％(v/v)，4天后結束培養，離 心收集培養液上清；將該培養液上清透析去離子，再經過CM-Sephrose?FF陽離 子交換樹脂層析柱，用0.05M?pH8.0?Tris-HCl連續洗脫，留取活性峰液，再透 析去離子，然后將透析過的洗脫液在凍干機上凍干，得到重組溶菌酶干粉。