[發明專利]一種短雙鏈干擾RNA的生成方法

無效

• 申請號: 200810229596.7
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101748115A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 肖懿
• 申請（專利權）人: 肖懿
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12P19/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種短雙鏈干擾RNA的生成方法，特別是一種以T7RNA聚合酶催化體外轉錄合成短雙鏈干擾RNA，然后采用的酚一氯仿抽提法獲得高純度的短雙鏈干擾RNA的生成方法，屬于生物、基因工程技術領域。

背景技術

RNA干擾是一種由小雙鏈RNA有效地作用于同源RNA序列誘發的″基因沉默″。在此過程中，經細胞內核酸酶作用使與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA被降解，從而抑制了致病基因的表達。RNA干擾技術在探查基因功能和治療人類疾病方面有廣闊的應用前景，在肝炎，艾滋病，癌癥，糖尿病，肥胖等多種疾病治療和藥物開發方面預期有突破性的進展。

實施RNA干擾技術主要有合成干擾用雙鏈RNA、雙鏈RNA導入細胞或體內、RNA干擾效應的檢測和觀察三部分內容，而獲得雙鏈RNA是進行RNA干擾研究的首要步驟。目前獲得雙鏈干擾RNA主要有三種辦法，即化學合成法、體外轉錄法和體內轉錄法。由于化學合成法的造價太高一般不被采用；體內轉錄法的基本思路是先在體外構建能表達雙鏈RNA的載體，再將載體轉移到細胞內由細胞自發轉錄生成雙鏈RNA，這樣在長期穩定表達載體的細胞株中，雙鏈RNA能夠長期發揮阻斷基因的作用。雖然體內轉錄法有明顯的優勢，但仍局限于少數物種和細胞系，載體表達效率及其作用規律還在研究之中。體外轉錄法有多種形式，但基本作法是以目標基因mRNA上的一段同源DNA序列為模板，并將其同T7啟動子引物褪火結合，然后在T7RNA聚合酶的作用下轉錄成RNA，兩個互補的RNA褪火結合成雙鏈RNA，但設計是基于38個堿基的寡核普酸轉錄模板上完成的，其5’端開始的2個堿基是隨機選取的，其結果轉錄出的RNA3’端末尾2個堿基也是隨機的。而且，合成的短雙鏈RNA僅僅直接用乙醇沉淀后溶解，未進行任何的提純。因此大大降低了目標基因的表達。

發明內容

本發明的目的在于在于克服現有技術中的不足，提供一種操作簡便、成本低、目標基因表達效率高的短雙鏈干擾RNA的生成方法，為大范圍、高通量進行RNA干擾研究提供短雙鏈干擾RNA合成方法。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明的方法流程如下：

1、目標基因干擾位置的選擇：

在互聯網生物數據庫GenBank上查詢要干擾基因的mRNA序列，在啟始密碼子(ATG)75個堿基后尋找AAG開始的20個堿基序列作為目標基因序列。

2、DNA寡核昔酸鏈的設計與合成：

設計合成一條T7啟動子DNA寡核苷酸鏈(18bP)，一條含AAG開始的目標基因正向序列(20bp)和T7啟動子反向互補序列(18bP)的DNA寡核苷酸鏈(38bP)，一條含從G開始的目標基因反向序列(20bp)和T7啟動子反向互補序列(18bP)的DNA寡核苷酸鏈(38bp)。

合成：首先18個堿基的T7啟動子DNA寡核苷酸同38個堿基的DNA寡核苷酸(含目標基因同源序列和T7啟動子寡核苷酸互補序列)退火形成雙鏈DNA，再在T7RNA聚合酶作用下轉錄生成短雙鏈RNA。

3、雙鏈DNA模板形成和體外轉錄：

將合成的T7啟動子DNA寡核苷酸鏈分別同含目標基因正、反向序列和竹啟動子反向互補序列的DNA寡核苷酸鏈，先在95℃下變性5分鐘，然后緩慢降溫便得到T7啟動子互補的雙鏈DNA，其中目標基因序列為單鏈。

4、短雙鏈干擾RNA的分離、提純：

首先在短雙鏈干擾RNA的分離、提純過程中增加了酚/氯仿抽提步驟，采用了酚/氛仿法對合成產物進行了提純，然后采用無水冷乙醉沉淀RNA，用70％的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40μl?PBS溶解，在反應體系每次可獲得20-40μg短雙鏈干擾RNA。

本發明的有益效果：

本發明獲得的短雙鏈干擾PNA能夠有效地敲低外源報告基因一綠熒光蛋白表達載體的表達，而且導入細胞的短雙鏈干擾RNA沒有非特異性免疫反應。本發明在38個堿基的寡核苷酸轉錄模板設計上有很大改動，既5’端開始的2個堿基選取2個腺嘌呤，其結果轉錄出的PNA3’端末尾2個堿基是尿嘧啶。當轉錄出的正、負兩條單鏈RNA??火形成雙鏈RNA時，兩端各垂懸的尿嘧啶。許多RNA干擾研究認為，這種結構的雙鏈RNA及其同RNA聚合酶III、RNA解旋酶等結合形成復合物更容易同目標基因的mRAN結合并切斷它，從而更有效地敲低目標基因的表達。另外，文獻對合成的短雙鏈RNA直接用乙醇沉淀后溶解，未進行任何的提純。本發明操作簡單、成本低、效率高，為大范圍、高通量進行RNA干擾研究提供了短雙鏈干擾RNA合成方法。

具體實施方式