[發明專利]一種短雙鏈干擾RNA的生成方法

無效

• 申請號: 200810229596.7
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101748115A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 肖懿
• 申請（專利權）人: 肖懿
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12P19/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種短雙鏈干擾RNA的生成方法，其特征在于本發明的方法流程如下：

(1)目標基因干擾位置的選擇：

在互聯網生物數據庫GenBank上查詢要干擾基因的mRNA序列，在啟始密碼子(ATG)75個堿基后尋找AAG開始的20個堿基序列作為目標基因序列。

(2)DNA寡核昔酸鏈的設計與合成：

設計合成一條T7啟動子DNA寡核苷酸鏈(18bP)，一條含AAG開始的目標基因正向序列(20bp)和T7啟動子反向互補序列(18bP)的DNA寡核苷酸鏈(38bP)，一條含從G開始的目標基因反向序列(20bp)和T7啟動子反向互補序列(18bP)的DNA寡核苷酸鏈(38bp)。

合成：首先18個堿基的T7啟動子DNA寡核苷酸同38個堿基的DNA寡核苷酸(含目標基因同源序列和T7啟動子寡核苷酸互補序列)退火形成雙鏈DNA，再在T7RNA聚合酶作用下轉錄生成短雙鏈RNA。

(3)雙鏈DNA模板形成和體外轉錄：

將合成的T7啟動子DNA寡核苷酸鏈分別同含目標基因正、反向序列和竹啟動子反向互補序列的DNA寡核苷酸鏈，先在95℃下變性5分鐘，然后緩慢降溫便得到T7啟動子互補的雙鏈DNA，其中目標基因序列為單鏈。

(4)短雙鏈干擾RNA的分離、提純：

首先在短雙鏈干擾RNA的分離、提純過程中增加了酚/氯仿抽提步驟，采用了酚/氛仿法對合成產物進行了提純，然后采用無水冷乙醉沉淀RNA，用70％的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40μl?PBS溶解，在反應體系每次可獲得20-40μg短雙鏈干擾RNA。