[發明專利]一種生物類黃酮色素

無效

• 申請號: 200810229595.2
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101748142A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 肖懿
• 申請（專利權）人: 肖懿
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體涉及一種生物類黃酮在觀賞植物中的表達。

背景技術

類黃酮類色素是一類液泡包素，主要存在液泡中，類黃酮的不同色素在液泡中的積累產生了各種花色，同時色素的組成和濃度的不同也是出現各種花色的原因。其中花色素和花色素苷是重要的顏色決定物質，也是花色生理水平的重要檢測指標。而類黃酮一3’5’一羥化酶(F3’5’H)是合成3’一，5’一帶羥基的花色素的關鍵酶和限速酶，F3’，5’H基因屬于細胞色素450單加氧酶(P450)超家族。細胞色素450單加氧酶(P450)是血紅素依賴的氧化酶，廣泛分布與各種生物中，具有非常復雜的功能，可以催化成千上萬的反應。在植物界分布也非常的廣泛，可以催化的反應超過50種，也涉及到類黃酮的合成。它在二氫黃酮醇的3’和5’位置選擇性的加入羥基，產生不同的花色素苷從而使得植物顯現出不同的顏色。這類色素呈現藍紫色，是藍花和紫花形成的原因。因此關于它的研究就成為花色研究領域中重要的一個組成部分。

發明內容

本發明的目的在于提出一種從觀賞植物中克隆出的生物類黃酮。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案，本發明的生物克隆具體操作步驟為：

1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis?hybrida)材料采自上海農業科學院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa?rosa，花色為紫色，白色，黃色；植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h；25一28℃)。

2、RNA提取：取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清轉移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗滌沉淀，重復一次。室溫干燥5一10min，溶于20μL?DEPC水中，測0D值，電泳檢測。

3、基因的克隆：通過對已發表的F3’5’H基因序列進行同源性比較，根據保守區設計兼并引物F和R，進行RT一PCR。

4、巢式PCR擴增：由于基因片段過大，上述步驟無法獲得完全基因序列，以3’RACE獲得F3’5’H基因的3’端；提取總RNA，逆轉錄為cDNA；依次使用多輪引物包括AP，AUAP，3GSPI，3GSP2，3GSP3，3GSP4進行巢式PCR擴增。

5、5’端及其上游序列以IPCR方法獲得：將基因組DNA以市售的XbaI、XhoI和SphI三種酶進行酶切；再酶切產物自連，以反式PCR擴增；進行三輪擴增反應，每一輪均使用前一輪的產物作為模版；最后得到的特異PCR特異產物連接到pGEM一T載體，克隆、測序。使用的引物包括5一l^a，5一2，5一3，5一4，5一5，5一6，5一7，5一8，3一l^b，3一2，3一3。

本發明的有益效果

F3’，5’H基因屬于細胞色素450單加氧酶(P450)超家族。細胞色素450單加氧酶(P450)是血紅素依賴的氧化酶，廣泛分布與各種生物中，具有非常復雜的功能，可以催化成千上萬的反應。在植物界分布也非常的廣泛，可以催化反應超過50種，也涉及到類黃酮的合成。它在二氫黃酮醇的3’和5’位置選擇性的加入輕基，產生不同的花色素營從而使得植物顯現出不同的顏色。

具體實施方式：

下面結合具體實施實例進一步闡釋本發明。應理解，這些實例僅以用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法進行。如Sambrook等分子克隆：實驗手冊(New?York：ColdSpring?Harbor?Labortary?PreSS，1989)中所述條件，或按照制造生產廠商的使用說明。

實施例1

本發明的生物克隆具體操作步驟為：

1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis?hybrida)材料采自上海農業科學院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa?rosa，花色為紫色，白色，黃色。植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h；25一28℃)。

2、RNA提取。取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清轉移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75％乙醇lmL洗滌沉淀，重復一次。室溫干燥5一10min，溶于20μL?DEPC水中，測0D值，電泳檢測。