[發明專利]一種生物類黃酮色素

無效

• 申請號: 200810229595.2
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101748142A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 肖懿
• 申請（專利權）人: 肖懿
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種生物類黃酮色素，其特征在于，本發明的生物克隆具體操作步驟為：

(1)蝴蝶蘭(Phalaenopsis?hybrida)材料采自上海農業科學院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa?rosa，花色為紫色，白色，黃色；植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h；25一28℃)。

(2)RNA提取：取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清轉移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗滌沉淀，重復一次。室溫干燥5一10min，溶于20μL?DEPC水中，測0D值，電泳檢測。

(3)基因的克隆：通過對已發表的F3′5′H基因序列進行同源性比較，根據保守區設計兼并引物F和R，進行RT一PCR。

(4)巢式PCR擴增：由于基因片段過大，上述步驟無法獲得完全基因序列，以3′RACE獲得F3′5′H基因的3’端；提取總RNA，逆轉錄為cDNA；依次使用多輪引物包括AP，AUAP，3GSPI，3GSP2，3GSP3，3GSP4進行巢式PCR擴增。

(5)5’端及其上游序列以IPCR方法獲得：將基因組DNA以市售的XbaI、XhoI和SphI三種酶進行酶切；再酶切產物自連，以反式PCR擴增；進行三輪擴增反應，每一輪均使用前一輪的產物作為模版；最后得到的特異PCR特異產物連接到pGEM一T載體，克隆、測序。