[發(fā)明專利]一種新的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810229486.0
• 申請(qǐng)日: 2008-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN101418039A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尚德靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C12N15/12;C12N15/70;C12N1/19;A61K38/10;A61P31/00;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 大連智慧專利事務(wù)所
• 代理人: 周志艦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于抗菌肽及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗菌和抗癌活性的中 國(guó)林蛙基因編碼的抗菌肽及其制備方法和制藥方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

近十年來，抗生素藥物的廣泛使用導(dǎo)致很多細(xì)菌和病毒對(duì)現(xiàn)有的抗生素都 產(chǎn)生了耐藥性，耐藥性病原株的擴(kuò)散使得抗生素的療效迅速下降甚至消失。因 此，尋找以全新的機(jī)制殺傷病原微生物，且不易形成耐藥性的新型抗生素已經(jīng) 成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

抗菌肽是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，一般 由20-60個(gè)氨基酸組成，分子量在1000-7000Da左右，具有熱穩(wěn)定、水溶性好、 廣譜抗菌等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)部分細(xì)菌、真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)大的殺 傷作用。這些基因編碼的抗菌肽的作用機(jī)理不同于傳統(tǒng)的抗生素，它不是通過 抑制細(xì)菌的代謝過程來殺死細(xì)菌，而是直接在細(xì)菌細(xì)胞膜上穿孔，使細(xì)胞內(nèi)的 活性物質(zhì)泄漏導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此，抗菌肽不存在使用后產(chǎn)生耐藥性的問題， 有望成為新一代的抗菌、抗病毒、抗癌藥物。

林蛙(Rana?chensinensis)是我國(guó)東北地區(qū)長(zhǎng)白山麓藥、食兩用的珍貴蛙種。 林蛙是兩棲類動(dòng)物，生存環(huán)境復(fù)雜多樣，它們的皮膚在維持它們生存和適應(yīng)廣 闊棲息地中起著重要作用，為了適應(yīng)生存環(huán)境，蛙類的皮膚中分布了種類繁多、 具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，是一個(gè)巨大的生物活性分子資 源庫和藥物資源庫。

兩棲動(dòng)物皮膚抗菌肽是其先天防御系統(tǒng)中的重要組成成分，由基因編碼， 核糖體合成，10-50個(gè)氨基酸殘基組成，分子表面帶有正電荷，大都可形成兩親 的α螺旋結(jié)構(gòu)。不同種屬兩棲動(dòng)物的抗菌肽在分子量，氨基酸組成，帶電性， 疏水性，空間結(jié)構(gòu)和抗菌譜等方面均各自不同。兩棲動(dòng)物皮膚抗菌肽大多都是 堿性多肽，容易與酸性的生物膜的層狀排列的脂類雙分子層相結(jié)合，依靠?jī)捎H 的α-螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)形成跨膜的離子通道，介導(dǎo)一系列的生物效應(yīng)，可以在不 損傷正常細(xì)胞的前提下對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和癌細(xì)胞有抑殺作用，近年來成為 國(guó)際上動(dòng)物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)，作為新一代抗生素，倍受人們關(guān) 注。

抗菌肽從發(fā)現(xiàn)到局部使用已經(jīng)經(jīng)歷了相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間，但對(duì)它們的分子 結(jié)構(gòu)及遺傳效應(yīng)研究較少，使得多數(shù)的抗菌肽無法應(yīng)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的具有抗菌活性和抗癌活性的抗菌肽，以及該 多肽的編碼序列和制備方法及其在制藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的抗菌肽temporin-1CEa，是中國(guó)林蛙基因編碼的抗菌肽，其全序列 為Phe?Val?Asp?Leu?Lys?Lys?Ile?Ala?Asn?Ile?Ile?Asn?Ser?Ile?Phe-NH₂，分子量為1733 道爾頓，可以形成明顯的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中國(guó)林蛙抗菌肽temporin-1CEa的編碼基因preprotemporin-1CEa，其 為：從中國(guó)林蛙皮膚分離提取總RNA，純化mRNA，mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，以cDNA為模板，GSP1/3′RACE外部引物為正反向引物，進(jìn)行第一次PCR， 以此產(chǎn)物為模板，GSP1/3′RACE內(nèi)部引物為正反向引物，進(jìn)行第二次PCR。

所用引物的核苷酸序列為：

引物GSP1：5′-ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG-3′；

3’RACE外部引物：TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT；

3’RACE內(nèi)部引物：CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG。

PCR程序如下：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30個(gè)循 環(huán)，72℃延長(zhǎng)10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3％瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段(見 圖1)，目的片段用BcaBEST?Primer?RV-M測(cè)序，得到中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽 temporin-1CEa完整核苷酸序列，序列全長(zhǎng)315bp，其序列見序列表。

抗菌肽temporin-1CEa的基因工程的制備方法如下：