[發(fā)明專利]以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810229197.0
• 申請日: 2008-12-02
• 公開（公告）號: CN101412991A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓國寶;王武良
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽華星生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/84
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司
• 代理人: 崔紅梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物制品的發(fā)酵技術(shù)，以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)生產(chǎn)甘露聚糖酶的方法是利用葡萄糖作碳源。葡萄糖作為碳源在高溫滅菌過程中，產(chǎn)生焦糖化反應(yīng)，使得發(fā)酵培養(yǎng)基溶液呈褐色或醬油色。其弊端是：第一，焦糖化反應(yīng)產(chǎn)生有害物，不利于酵母菌的生長；第二，深色發(fā)酵液的后處理工作需要脫色，增加生產(chǎn)工序和費用。第三，不加入底物甘露聚糖進行誘導，產(chǎn)率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，可顯著增加甘露聚糖酶產(chǎn)量15％~24％。

本發(fā)明的以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，采用以畢赤酵母做載體生產(chǎn)甘露聚糖酶的基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，同葡萄糖為碳源的酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種，其特征是：在一級種子培養(yǎng)發(fā)酵罐中用含葡萄糖、蛋白胨和酵母粉的種子培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；在二級種子培養(yǎng)發(fā)酵罐中以含甘油的基礎(chǔ)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；在生產(chǎn)發(fā)酵罐中，初期投入部分含甘油的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在發(fā)酵過程的各階段，分別流加甘油、甲醇和底物甘露聚糖至發(fā)酵液中，并調(diào)整流速，以完成發(fā)酵。

工藝改進后的效果：

底物是酶制劑作用的目標，甘露聚糖是甘露聚糖酶的底物。在發(fā)酵過程中加入底物甘露聚糖主要起刺激誘導的作用。本發(fā)明方法以甘油代替?zhèn)鹘y(tǒng)的葡萄糖為碳源并流加底物甘露聚糖，在以畢赤酵母為載體生產(chǎn)甘露聚糖酶的基因工程菌生產(chǎn)工藝中所產(chǎn)生的積極效果是：

a、在生產(chǎn)中以甘油為碳源，與以葡萄糖為碳源相比，可以顯著減少代謝阻遏物乙醇乙酸的產(chǎn)生，從而增加了最終生產(chǎn)的甘露聚糖酶的量。

b、應(yīng)用甘油作為碳源進行生產(chǎn)，因為甘油作為碳源在高溫滅菌過程中不會產(chǎn)生焦糖化反應(yīng)，所以可以大大改善發(fā)酵液的顏色，從而使酵母菌可以正常生長。

c、因為甘油為碳源大大改善了發(fā)酵液的顏色，發(fā)酵液顏色淺不需脫色處理，減少了發(fā)酵液處理費用，可以降低10％的生產(chǎn)費用。

d、流加底物甘露聚糖，可以起到刺激誘導的作用，從而提高了甘露聚糖酶最終的產(chǎn)?量。

e、利用本方法生產(chǎn)甘露聚糖酶，最終產(chǎn)甘露聚糖酶量比以葡萄糖為碳源且不流加底物甘露聚糖的生產(chǎn)工藝增加15～24％，而生產(chǎn)成本僅為傳統(tǒng)工藝成本的不足90％。

具體實施方式

一種以甘油為碳源并流加底物甘露聚糖誘導制備甘露聚糖酶的方法，采用以畢赤酵母做載體生產(chǎn)甘露聚糖酶的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于以甘油為碳源并流加底物甘露聚糖，具體工序如下：

一、培養(yǎng)基

1.種子培養(yǎng)基：含重量百分比為葡萄糖3％，蛋白胨2％，酵母粉2％，余量為水；

2.基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含重量百分比為甘油2％～10％，磷酸二氫鉀1％～5％，硫酸鉀1％～5％，純度為85％的磷酸1％～5％，七水硫酸鎂1％～5％，余量為水。所用所有甘油均要求純度為99.8％以上。

二、發(fā)酵工藝

1、菌種的培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)和一級種子發(fā)酵時采用種子培養(yǎng)基。

a.取適量生產(chǎn)用產(chǎn)甘露聚糖酶菌種培養(yǎng)斜面，分別接入3～4只1000ml三角瓶中，內(nèi)裝500ml種子培養(yǎng)基；

b.培養(yǎng)：30～32℃，250～350轉(zhuǎn)/分鐘，生長20～30小時。

2、一級發(fā)酵

a、在不銹鋼種子罐中裝入約占罐容積的70％的種子培養(yǎng)基，蒸汽滅菌121℃，15min，冷卻至30℃；

b、取上述步驟1培養(yǎng)好的搖瓶菌種接入種子培養(yǎng)液中；

c、培養(yǎng)：30℃，200～300轉(zhuǎn)/分鐘，pH在4.0～6.0范圍內(nèi)保持某一恒定值，通氣量0.5～2vvm，生長20～30小時。

3、二級發(fā)酵

a.在不銹鋼種子罐中裝入約占罐容積70％～75％的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，蒸汽滅菌121℃，15min，冷卻至30℃；

b.在二級種子培養(yǎng)發(fā)酵時和發(fā)酵生產(chǎn)的初始階段均采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液。將上述步驟2培養(yǎng)好的菌種液在無菌狀態(tài)下接入二級種子罐中；

c.培養(yǎng)：30℃，200～300轉(zhuǎn)/分鐘，pH在4.0～6.0范圍內(nèi)保持某一恒定值，通氣量0.5～2vvm，生長12～30小時。

4、生產(chǎn)發(fā)酵

a、不銹鋼發(fā)酵罐中投入相當于發(fā)酵罐容積35～45％的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，蒸汽滅菌121℃，15min，冷卻至30℃；

b、將上述步驟3培養(yǎng)好的菌種液在無菌狀態(tài)接入發(fā)酵罐中；

c、培養(yǎng)發(fā)酵：