[發明專利]以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法

無效

• 申請號: 200810229197.0
• 申請日: 2008-12-02
• 公開（公告）號: CN101412991A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: 韓國寶;王武良
• 申請（專利權）人: 沈陽華星生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/84
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司
• 代理人: 崔紅梅

1.以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，采用以畢赤酵母做載體生產甘露聚糖酶的基因工程菌的發酵生產工藝，其特征是：在一級種子培養發酵罐中利用種子培養液進行培養：菌種培養和一級種子發酵時采用種子培養基，其組份重量百分比為葡萄糖3％，蛋白胨2％，酵母粉2％，余量為水；在二級種子培養發酵罐中以基礎培養液進行培養：在二級種子培養發酵時和發酵生產的初始階段均采用基礎培養液，其組份重量百分比為甘油2％～10％，磷酸二氫鉀1％～5％，硫酸鉀1％～5％，純度為85％的磷酸1％～5％，七水硫酸鎂1％～5％，余量為水；在生產發酵罐中，初期投入部分基礎培養液進行培養，隨著發酵過程的進行按一定的比例和速度分別流加甘油、甲醇和底物甘露聚糖至發酵液中以完成發酵；流加甘油水溶液的濃度為50％；流加甲醇的濃度為99.8％以上；流加甘露聚糖溶液的濃度為0.002～0.5％；誘導工序中在甘油勻速流加4h或更長時間后，至細菌生產量為200～250g濕重/L，且發酵液無可見的重組蛋白的產生時，開始流加甲醇，甲醇流加過程持續到發酵完成前10～15小時；初始的流加速度為4～7ml/h/L，隨著培養的持續及培養物的快速累積，需相應增大甲醇的流加量至8～10ml/h/l；甲醇開始流加3～5h后，畢赤酵母工程菌開始產甘露聚糖酶時，開始并根據甘露聚糖酶的活力，同時流加0.002～0.5％的甘露聚糖溶液，以0.5～1ml/h/l的速度流加持續30～50小時，直到結束發酵。

2.根據權利要求1所述的以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，其特征在于：在種子培養和發酵生產中，發酵液的終體積均保持占發酵罐總容積的70％～75％。

3.根據權利要求1所述的以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，其特征在于：在發酵過程中以甘油作為碳源代替了葡萄糖，并流加底物甘露聚糖進行刺激誘導以生產更多的甘露聚糖酶。

4.根據權利要求1所述的以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，其特征在于：當基礎培養液中甘油消耗完全后，用甘油測量計測定殘糖含量為0時，以10～40ml/h/l的流速流加50％甘油溶液至發酵培養基中；在開始流加甲醇之后，將甘油的流加速度降至1～4ml/h/l。

5.根據權利要求1所述的以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，其特征在于所用所有甘油均要求純度為99.8％以上。

6.根據權利要求1所述的以甘油為碳源并流加底物誘導制備甘露聚糖酶的方法，其特征在于：種子發酵和生產發酵的培養條件均為30℃，200～300轉/分鐘，pH在4.0～6.0范圍內保持某一恒定值，通氣量0.5～2vvm，生長12～30小時。