[發明專利]表達顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌

無效

• 申請號: 200810225730.6
• 申請日: 2008-11-10
• 公開（公告）號: CN101392233A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 邢新會;韓冰;蘇濤;江皓;楊程;吳昊
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N1/19;C12N15/53;C12N15/63;C12N9/02;C12R1/01;C12R1/40;C12R1/38;C12R1/385;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及一種表達顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌。

背景技術

甲烷是重要的化工原料和化學能源，在人類的生產生活中扮演著重要的作用；同時也是造成溫室效應最為重要的氣體之一。有效、合理地利用甲烷，必將對全球能源利用、環境保護和循環經濟產生重大的影響。由于甲烷是最穩定的烷烴化合物，C-H鍵能為104kcalmol^-1，因此，甲烷直接轉化其它高附加值化學品對于化學科學和工程都是一個很大的挑戰。特別的，現有工藝通過氧化甲烷生成甲醇需要非常苛刻的反應條件，經過長期的工藝改進和催化劑改良，目前工業上從甲烷生產甲醇仍需255℃的溫度和5～15MPa的壓力。此外，這些工藝過程中所用的甲烷一般來自于天然氣，但在自然界中分布廣、密度低的沼氣等甲烷資源由于其純度較低，不能作為工業催化的原料。

自然界中的一類特殊微生物——甲烷氧化菌——可以在常溫常壓的情況下，依靠體內的甲烷單加氧酶無污染的實現甲烷到甲醇的專一性轉化。甲烷單加氧酶不僅可以將甲烷轉化成為甲醇，而且還可以催化其它一系列的單加氧反應，可以廣泛地應用于生物轉化及環境治理。如果能將甲烷單加氧酶進行表達，開發出一種細胞形態生物催化劑，那么在常溫常壓下就能將天然氣轉化為甲醇。這將大大降低甲醇的生產成本，是一種高度節能的、環境友好的甲醇生產工藝。同時，以可再生資源為原料通過厭氧甲烷發酵可以提供廉價的甲烷，是實現循環工業的極具潛力的一條途徑。因此甲烷的資源化利用技術的研發具有重要的工業應用價值。

甲烷單加氧酶(EC.1.14.13.25，Methane?Monooxygenase，簡稱MMO)分兩種，一種是可溶性的甲烷單加氧酶(soluble?methane?monooxygenase，簡稱sMMO)，另一種是與細胞膜結合的顆粒狀甲烷單加氧酶(particulate?methane?monooxygenase，簡稱(pMMO)。盡管sMMO和pMMO都能氧化甲烷生成甲醇，但二者還是存在很多的不同。sMMO存在于細胞質中，它底物范圍廣，許多的烴類化合物和芳香族化合物都能被氧化。與sMMO相比，pMMO的底物選擇性相對較窄，只能氧化五碳以內的烷烴和烯烴，不能氧化芳香烴。但是pMMO卻具有很多sMMO不具備的優勢。pMMO存在于細胞膜上而不是細胞質中。該性質有利于底物與酶的接觸和反應產物及時排出，意味著該酶催化的反應傳質阻力更低，因而有利于在生物轉化中應用。pMMO存在四級結構，由三個亞基組成(分別是23kDa的pmoC、27kDa的pmoA和45kDa的pmoB，Genbank31650?AF186586)，pMMO是α₃β₃γ₃的三聚體結構，銅離子位于pmoB中。盡管在pMMO酶分子研究方面取得了一系列的進展，而且Methylococcus?capsulatus(Bath)和Methylosinus?trichosporium?OB3b的pmo基因已經克隆測序，但pMMO的重組異源表達卻進展甚微，至今在大腸菌及其他宿主細胞中沒有表達成功。但pMMO的異源表達技術仍不成熟，既便有個別成功的例子，但重組菌的活性僅為原始菌的千分之一，不能得到高活性的表達。主要原因是pMMO的異源表達大都以大腸桿菌為宿主，得不到轉化子，推測是pMMO的表達產物對大腸菌具有毒害作用。

盡管利用野生型甲烷氧化菌能夠將甲烷轉化甲醇，但是其在大規模的工業應用還存在一系列難以克服的技術問題。首先，甲烷氧化菌的培養比較困難，與其他工業應用的微生物相比增殖速度極慢，而且能夠得到的細胞密度低。盡管通過添加特殊底物(氯甲烷、有機酸、維生素或甲醇等)能促進甲烷氧化菌生長，但其生長速度還是遠遠低于其它菌類。其次，利用野生甲烷氧化菌進行甲烷轉化甲醇的過程中，甲醇的積累不易控制。在這些菌中都含有甲醇脫氫酶，因此甲醇會進一步地被氧化成為甲醛，進一步進入的細胞合成代謝。如果加入特殊的化學試劑，選擇性地抑制甲醇脫氫酶的活性，這樣雖然暫時促進甲醇的積累，但細胞的代謝途徑卻被中斷，特別是阻止細胞的輔酶再生，嚴重影響細胞的代謝活性，進而阻止甲烷氧化反應。這主要是因為對于甲烷氧化菌而言，MMO氧化甲烷所需的NADH只能由甲醛進入相應的代謝途徑后才能產生，因此如果將細胞控制在生產甲醇這一步的話，胞內原有的NADH被耗竭時，反應就停止了。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌。