[發(fā)明專利]表達顆粒狀甲烷單加氧酶的方法及其專用工程菌

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810225730.6
• 申請日: 2008-11-10
• 公開（公告）號: CN101392233A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邢新會;韓冰;蘇濤;江皓;楊程;吳昊
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N1/19;C12N15/53;C12N15/63;C12N9/02;C12R1/01;C12R1/40;C12R1/38;C12R1/385;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢

1、表達顆粒狀甲烷單加氧酶的工程菌，是將表達顆粒狀甲烷單加氧酶的重組表達載體導(dǎo)入宿主菌中，篩選得到的表達顆粒狀甲烷單加氧酶的重組菌株。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述重組表達載體為含有單加氧酶的啟動子及其下游連接的顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因的可在宿主菌中表達的載體。

3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述單加氧酶基因的啟動子為烷烴單加氧酶基因的啟動子或顆粒狀甲烷單加氧酶基因的啟動子；所述烷烴單加氧酶基因的啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號為AJ302087的5′端第2008—2150位核苷酸序列，所述顆粒狀甲烷單加氧酶基因的啟動子的核苷酸序列為自GENBANK號為U31650?AF186586的5′端第34—499位核苷酸序列。

4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因的核苷酸序列為自GENBANK號為U31650?AF186586的5′端第500bp—3743bp位核苷酸序列。

5、根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的工程菌，其特征在于：所述工程宿主菌為產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter?aerogenes)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)、施氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，甲基扭曲桿菌(Methylobacterium?extorquens)、巴氏畢赤酵母(Pichia?pastoris)或釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)。

6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述重組表達載體是將顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因插入到pCom10的NdeI和HindIII酶切位點之間或?qū)⑺鰡渭友趺富虻膯幼蛹捌湎掠芜B接的所述述顆粒狀甲烷單加氧酶的編碼基因插入到pCom10的EcoRI和HindIII酶切位點之間得到的可表達顆粒狀甲烷單加氧酶的重組載體，所述pCom10的核苷酸序列為自GENBANK?Accession?Number為AJ302087的第1-7675位核苷酸。

7、一種表達顆粒狀甲烷單加氧酶的方法，是誘導(dǎo)表達權(quán)利要求1—6中任意一項所述的工程菌，得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌液。

8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)表達的方法為發(fā)酵至對數(shù)生長期的權(quán)利要求1—6中任意一項所述的工程菌的發(fā)酵液中，加入體積百分含量為0.05％的正辛烷，在15-20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時得到含有顆粒狀甲烷單加氧酶的發(fā)酵菌液。