[發(fā)明專利]一種構建腦心肌炎病毒感染性克隆的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810225311.2
• 申請日: 2008-10-29
• 公開（公告）號: CN101386860A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發(fā)明（設計）人: 楊漢春;蓋新娜;郭鑫;張國慶;朱書
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/63
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種構建腦心肌炎病毒 的感染性克隆的方法。

背景技術

腦心肌炎是豬、某些哺乳動物乃至靈長類動物以腦炎、心肌炎或 心肌周圍炎為主要臨床特征的急性傳染病，由腦心肌炎病毒 (Encephalomyocarditis?virus，EMCV)引起。EMCV的宿主范圍很廣， 在多種嚙齒類動物、野生動物和靈長類動物均有發(fā)現(xiàn)，人也可感染， 但大多數(shù)不出現(xiàn)任何癥狀。豬是感染EMCV最廣泛、最嚴重的動物， 除能引起仔豬致死性心肌炎和腦炎外，還能引起母豬繁殖障礙。

目前國內對豬腦心肌炎尚無有效的治療藥物和疫苗，主要靠綜合 性防制措施加以預防。由于EMCV在豬和人之間有密切聯(lián)系，病毒在 豬體內可引起持續(xù)感染，而豬的組織器官又是人體組織器官移植的重 要來源，因此對該病毒的研究越來越受到關注。

EMCV屬微RNA病毒科心肌病毒屬成員，其基因組為單股正鏈 RNA，在復制過程中不形成DNA中間體，而大多數(shù)基因工程操作技 術都是在DNA分子水平上進行操作，對EMCV的分子病毒學研究因此 受到限制。隨著RNA病毒全長感染性cDNA克隆技術的建立，研究者 可以有效利用病毒的全長cDNA為模板，體外轉錄出感染性RNA，以 拯救RNA病毒。感染性克隆就是指在細菌質粒中含有病毒全基因組的 cDNA拷貝，使得cDNA本身或從cDNA體外轉錄所得的RNA具有感染 性。感染性克隆提供的全長cDNA模板具有基因型穩(wěn)定、易操作的特 點，使在基因組水平上研究RNA病毒的單個基因和點突變成為可能， 在研究病毒致病力、病毒各蛋白的功能和病毒復制，甚至在闡明病毒 致病機理以及疫苗研制等方面都是十分有用的工具。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種構建腦心肌炎病毒感染性克隆的方法， 為腦心肌炎病毒的分子病毒學研究和疫苗的研制等提供有效的工具。

本發(fā)明構建腦心肌炎病毒的感染性克隆的方法，包括以下步驟：

(1)改造低拷貝質粒載體，使其只含有構建感染性克隆所需的 酶切位點；

(2)提取腦心肌炎病毒的總RNA；

(3)用RT-PCR方法分三個片段擴增腦心肌炎病毒的全長cDNA， 獲得的三個片段的cDNA兩端分別含有不同的酶切位點；

(4)將三個片段的cDNA分別建立亞克隆；

(5)用雙酶切的方法將三個片段的cDNA依次定向克隆至改造的 低拷貝質粒載體中，得到含有腦心肌炎病毒全長cDNA的腦心肌炎病 毒感染性克隆。

其中，用RT-PCR方法分三個片段擴增腦心肌炎病毒的全長cDNA 時，在腦心肌炎病毒的5′端非翻譯區(qū)前加入T7RNA聚合酶啟動子核 心序列，亦能夠通過定點突變形成新的酶切位點，作為感染性克隆的 遺傳標記，以利于其鑒定。

本發(fā)明構建腦心肌炎病毒的方法分三個片段擴增病毒的cDNA， 所擴增的片段相對較短，能夠更好地保證所擴增片段序列的保真性， 同時也降低了長片段擴增的操作難度；采用雙酶切定向克隆，使連接 的效率和準確性大大提高；在5’非翻譯區(qū)前加入的T7RNA聚合酶啟 動子核心序列能夠保證感染性克隆在體外轉錄時產生高豐度高質量 的mRNA，大大提高了轉染的成功率。因此用本發(fā)明方法所構建的腦 心肌炎病毒感染性克隆非常穩(wěn)定，由該感染性克隆拯救出的腦心肌炎 病毒具有侵染性，且拯救病毒的生長特性和在模式動物上的致病性與 其親本病毒具有較高的一致性。

本發(fā)明方法操作難度較小，可控性較強，所獲得的穩(wěn)定的腦心肌 炎病毒感染性克隆使在病毒基因組上進行分子生物學操作變得簡單 易行，從而使在感染性克隆基礎上以突變、置換、插入、缺失等手段 對腦心肌炎病毒進行基因功能研究成為可能，同時為新型病毒活載體 疫苗的研制提供了必要的平臺。

附圖說明

圖1感染性克隆pWSKBJC3/w全長質粒的構建方案和簡略步驟

圖2BJC3三個片段A、B、C的RT-PCR擴增產物

圖3rVBJC3W和BJC3在BHK-21細胞上產生的細胞病變

圖4rVBJC3W遺傳標記的酶切鑒定

圖5rVBJC3W感染BHK-21細胞的間接免疫熒光檢測結果

圖6rVBJC3W和BJC3在BHK-21細胞中的生長動力學曲線

圖7rVBJC3W和BJC3的小鼠存活曲線