[發明專利]母系遺傳耳聾線粒體基因1494位C-T和1555位A-G突變的檢測方法及其試劑盒

無效

• 申請號: 200810223411.1
• 申請日: 2008-09-27
• 公開（公告）號: CN101684498A
• 公開（公告）日: 2010-03-31
• 發明（設計）人: 董大光
• 申請（專利權）人: 董大光
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 何文彬

技術領域：

本發明涉及基因工程技術領域，具體講是涉及母系遺傳耳聾線粒體基因 1494位C—T突變和1555位A—G突變的檢測方法。本發明還涉及制備根據該 方法的體外檢測母系遺傳耳聾線粒體基因1494位C—T突變和1555位A—G突 變的試劑盒，以及該試劑盒在檢測所述的1494位C—T突變和1555位A—G突 變中的應用。

背景技術：

氨基糖甙類抗生素(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小諾霉素 等)因其廣譜高效的抗菌作用以及低廉的價格在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏 陰性和陽性菌感染，但此類抗生素具有嚴重的耳毒性作用，可使患者發生不可 逆轉的聽力損失。近十年來研究發現，部分氨基糖甙類抗生素致聾患者有母系 遺傳家族史，并與線粒體DNA12S?rRNA基因1494C—T和1555A—G均質性點 突變有關。單次劑量的氨基糖甙類藥物應用即可導致攜帶1494C—T或1555A— G突變個體的重度聽力損失。根據目前已有的研究結果可知，幾乎攜帶1494C —T或1555A—G突變的個體在應用不同劑量的氨基糖甙類抗生素后均可發生 嚴重或者較嚴重的聽力損失，是后天性獲得性耳聾發生的重要原因。鑒于這一 耳聾的有明確的基因變化和誘發因素，使得這種耳聾成為一種可以預防的疾病。

1555位A—G突變和1494位C—T突變會在12S?rRNA的高度保守的A位 形成新的1494C-G1555或1494U-A1555堿基對。這些改變使得12S?rRNA在二 級結構上與細菌的16S?rRNA的相應區域的二級結構更加相似，因此，由于1494C —T和1555A—G突變在12S?rRNA形成U-A和G-C配對使線粒體與氨基糖甙 類抗生素的結合更加容易，所以帶有這些突變的人在接觸了氨基糖甙類抗生素 時會出現或加重耳聾。

線粒體DNA1555位A—G突變較為為常見，發生率約為1～3％ (Mkaouar-Rebai?E等，Biochem?Biophys?Res?Commun2006，340：1251-1258； OStergaard?E等，Clin?Genet2002，62：303-305；Usami?S等，J?Med?Genet2000， 37：38-40)，而線粒體DNA1494位C—T突變在中國耳聾人群中的發生頻率為 0.45％(李琦等，中國聽力言語康復科學雜志，2008)，考慮到尚有很多同類家系 尚未被發現報道，以及1494C—T和1555A—G突變在散發性耳聾的致病機制中 占有一定的比例，對這種耳聾的預防變得更為重要，其預防的關鍵環節在于通 過篩查，檢測發現攜帶線粒體1494C—T和1555A—G突變的個體，絕對禁止此 類個體接觸氨基糖甙類抗生素，從而避免嚴重的耳毒性反應發生。

自1993年以來，對此突變的檢測除了直接測序外，最常用的篩選方法為 BsmA?I(Alw261)酶切法(Fischel-Ghodsi等，Am?J?Otolaryngol，1993，14：399-403； Fischel-Ghodsian等，Am?J?Otolaryngol，1997b，18：173-178；袁慧軍等，中華耳鼻 咽喉科雜志，1998，33：67-70)。在國內外，普遍應用限制性酶BsmAI(Alw261) 酶切配合序列分析鑒定有無線粒體DNA1555A—G突變，酶切鑒定方便快捷， 結果可靠，但不足的是BsmA?I(Alw261)價格較貴，與常用的限制性酶相比，價 格差異達50～100倍。

專利號為ZL03156762.2的專利公開了一種線粒體1555位A—G突變的檢測 方法及試劑盒，此專利通過在線粒體DNA的1555位鄰近引入一個包括1555 位在內的新的限制性酶位點，然后用相應的限制性酶消化，從而檢測該突變的 存在。此方法簡單快捷而且成本低，但不能達到快速、準確、成本低并且同時 檢測1494C—T和1555A—G兩個突變的要求。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對現有技術中檢測線粒體DNA的1494位C —T突變和1555A—G突變的方法所存在的缺陷，提供一種簡單、快速、成本低 并且同時檢測兩個突變位點的方法。

本發明要解決的另一個的技術問題是提供一種根據上述方法的體外檢測母 系遺傳耳聾線粒體基因1494位C—T突變和1555位A—G突變的試劑盒。

本發明要解決的再一個技術問題是該試劑盒在檢測所述的1494位C—T突 變和1555位A—G突變中的應用。