[發(fā)明專利]表達禽流感病毒H9亞型HA蛋白的重組新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810222776.2
• 申請日: 2008-09-24
• 公開（公告）號: CN101376027A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發(fā)明（設計）人: 步志高;陳化蘭;葛金英
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/17;A61P31/14;A61P31/16;C12N15/45
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 吳小明

技術領域

本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種表達編碼 禽流感病毒H9亞型血凝素(HA)蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒 疫苗，更具體地，重組新城疫LaSota弱毒疫苗是rL-H9HA。本發(fā)明還公 開了制備所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和該重組新城疫LaSota 弱毒疫苗在制備預防禽流感和新城疫的雙價疫苗中的應用。

背景技術

世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的A類傳染病中，包括兩種禽類烈性 傳染病，分別為高致病性禽流感和新城疫。高致病性禽流感除H5或H7 亞型AIV以外，還有可感染人的H9亞型AIV，具有更為重要的公共衛(wèi)生 意義。采用新城疫弱毒疫苗構建防制高致病性禽流感重組病毒活載體疫 苗，可以真正實現(xiàn)一種疫苗預防兩種重大疫病。現(xiàn)有禽流感滅活疫苗具安 全、免疫保護效果好的優(yōu)點，但仍存在著制造成本高、使用相對不便的不 足^[1，2，3]。研制高效安全、成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的現(xiàn) 實意義。

AIV屬于正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒，血凝素(HA)是 禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可誘導機體產生抗體介導的特異性體液 免疫應答，抗HA的抗體可以通過干擾病毒與唾液酸受體的結合或者病毒 囊膜與內吞體膜的融合過程從而中和病毒的感染。

重組新城疫病毒(Newcastle?disease?virus，NDV)可同時誘導體液免 疫、細胞免疫和粘膜免疫^[4，5]，是所有疫苗形式中最為理想的免疫方式；經 過多年的臨床應用檢驗，NDV遺傳相對穩(wěn)定，毒株間發(fā)生重組及毒力返 強可能性極小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的雞胚生長特性，生 產成本低廉，便于規(guī)模化生產。因此，NDV作為疫苗載體具有廣闊的應 用空間和巨大的經濟意義。

負鏈RNA病毒的反向遺傳操作(Reverse?genetic)是通過操作病毒基 因組cDNA制造新病毒的過程，其基本過程是：①組裝完整的病毒基因組 (或重組型基因組)cDNA克隆，5’末端精確地綴于T7啟動子后，3’末端 精確綴于自我剪切的核酸酶序列和T7轉錄終止信號之前，構成基因組 cDNA轉錄模板；②以基因組cDNA轉錄模板與啟動病毒復制必須的轉錄 相關功能結構蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的 表達質粒(T7啟動子)一起，共轉染整合表達T7聚合酶的病毒復制許可 細胞；③24-72小時后收獲培養(yǎng)上清，過濾后繼續(xù)敏感細胞傳代或接種雞 胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。對基因組cDNA進行突變、缺失或外源基 因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse?genetic?system，RGS系統(tǒng)) 可獲得相應的突變或重組的負鏈RNA病毒。

申請人之前獲得授權的中國專利“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作 系統(tǒng)及其應用”(申請?zhí)?00510097997.8，申請日2005年9月2日)已經 建立了一種新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，并且成功拯救 了野生型病毒株，并且為進一步開展新城疫病毒活載體疫苗研制及NDV 病毒相關基礎奠定了堅實的基礎。

發(fā)明內容

針對上述研究背景，本發(fā)明人為進一步提高禽流感病毒表達抗原的免 疫原性，構建表達禽流感病毒H9亞型HA免疫原蛋白的重組NDV活載體 二聯(lián)弱毒疫苗rL-H9HA，通過滴鼻、點眼、肌肉注射甚至飲水、噴霧吸入 等多種途徑免疫動物以誘導對禽流感的保護免疫反應，用于禽類新城疫與 禽流感(H9亞型)的預防免疫。

因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種表達編碼禽流感病毒H9亞型血 凝素(HA)蛋白的基因的重組新城疫LaSota弱毒疫苗。

在一個實施方案中，所述用于表達HA蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗 是AV1615(購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC))。

在一個實施方案中，所述禽流感病毒H9亞型血凝素(HA)蛋白的氨 基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

在另一個實施方案中，所述編碼禽流感病毒H9亞型血凝素(HA)蛋 白的基因的序列如SEQ?ID?No.2所示。

在另一個實施方案中，所述重組新城疫LaSota弱毒疫苗為rL-H9HA。

本發(fā)明還有一個目的是提供本發(fā)明的重組新城疫LaSota弱毒疫苗在 制備預防禽流感和新城疫的雙價疫苗中的應用。